分散固相萃取净化UPLC测定烟草中4种水溶性糖

黄淼，杨敬国，姬厚伟，惠非琼，王芳，庞红蕊，黄锡娟，刘剑

贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵阳市小河区开发大道96号 550009

烟草调制后其糖类物质通常占烟草干重的25%～50%，主要包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等，是烟草内在质量重要评价指标之一[1,2]。由于糖类物质在卷烟燃烧过程中能生成多种致香化合物，是重要的香味物质前体物，其含量的多少是影响卷烟的感官品质重要因素之一[3,4]，因此，烟草中糖类化合物的准确定量分析一直是研究热点。

目前，针对糖的分析检测，发展了各种分析方法，因糖类化合物极性较大、沸点高，液相色谱法较为常用，如高效液相色谱法[5]、超高效液相色谱法[6]、离子色谱法[7]等，而气相色谱法通常需要衍生化处理，步骤繁琐，应用相对较少[8]。近年来串联质谱技术的使用，使得烟草中糖类化合物的检测方法灵敏度、选择性有了很大提高，但是设备昂贵，检测成本高[9,10]。现有此4种糖的烟草行业标准（YC/T447-2012）[11]，但该标准方法样品处理及分析时间都较长。本实验与该标准相比，改变前处理方式，实现快速检测；同时采用超高效液相色谱，加强检测效率。

本实验基于超高效液相色谱的分析速度快、分离度和灵敏度高的优势，同时前处理样品经涡旋振荡后采用分散固相萃取净化，建立了一种高效的超高效液相色谱-蒸发光散射检测的烟草中4种水溶性糖的快速分析方法，旨在为烟叶质量评价和卷烟产品开发提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

烟叶样品（选自卷烟企业）；乙腈 （色谱纯，美国Fisher公司）；D-果糖，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，纯度＞99%（北京百灵威科技有限公司）。

固相吸附剂：Florisil （弗罗里）、石墨化碳、丙磺酸、硅胶、PSA（N-丙基乙二胺键合固相吸附剂）SPE散装吸附剂（上海安谱实验科技股份有限公司）。

AcquityTM超高效液相色谱仪(UPLC,美国Waters公司)；高速离心机(德国Hettich公司)；涡旋振荡仪（美国Talboys公司）；超纯水仪 (美国Millipore公司)；分析天平AG104（感量：0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 样品前处理

准确称取0.2 g粉碎烘干后的烟叶样品于50mL试管中，先加入25 mL溶剂，振荡5 min后静置3 min，取上层清液2 mL，加入固相吸附剂0.2 g，涡旋振荡5 min后离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜于色谱瓶，待分析。

1.3 UPLC分析条件

分析柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1×100 mm, 1.7 μm)；柱温：45℃； 进样量：2 μL；流速：0.15 mL/min；流动相A为0.2%三乙胺/乙腈溶液，B为去离子水；洗脱程序为梯度洗脱。ELSD条件：漂移管温度50 ℃，载气30 Psi，喷雾器模式为冷却，增益为100 bps。通过标准样品对比保留时间定性，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂的优化

本实验考察了不同比例的乙腈/水溶液对烟草样品中的水溶性糖的萃取效果，结果如图1所示，当80%乙腈/水作为萃取溶液时，四种糖的含量均达到最高，萃取效果最佳，因此本实验选择80%乙腈/水溶液作为萃取溶剂。

图1 不同萃取溶剂对烟草中4种糖含量的影响Fig.1 Effect of the different proportion of extraction solution on the contents of 4 sugars in the tobacco

2.2 萃取方式的优化

样品以80%乙腈/水溶液萃取，经涡旋振荡5 min后，考察了超声时间从0分钟到10分钟时不同超声时间下4种糖的萃取效率，结果发现超声时间对四种糖的含量影响不大。因此，本实验仅采用涡旋振荡5分钟的操作对样品进行前处理，节省了大量的前处理时间。

2.3 样品净化条件的优化

烟草样品基质组分复杂，萃取液通常含有较多的植物碱、蛋白质、色素等干扰成分。为了减少基质干扰和减低色谱柱污染，本实验选取常用的固相吸附剂如石墨化碳、弗罗里、硅胶土、丙磺酸、PSA作为分散固相吸附剂。如图2所示，以不加吸附剂的待测样品作为对照组，弗罗里、硅胶土、丙磺酸、PSA这4种吸附剂均会使糖的含量偏低，而石墨化碳所测的糖的含量和对照组相比结果较为一致。可能是由于这些吸附剂具有一定的极性，对糖类化合物有一定吸附作用，从而使得测定结果偏低，因此选择石墨化碳作为吸附剂。

图2 不同吸附剂对样品含量的影响Fig.2 Effect of the different disperser adsorbents on the contents of analytes

为了进一步优化吸附剂的用量，本实验考察了0.05 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.5 g的石墨化碳吸附剂对2 mL样品溶液的净化效果。实验发现当其质量为0.2 g时，萃取溶液和对照样相比已变得澄清，达到净化效果。且发现不同量石墨化碳吸附剂对糖的含量几乎没有影响，因此，本实验选择0.2 g吸附剂，即可满足实验需求。

2.4 色谱条件的选择

本实验以0.2% 三乙胺/乙腈（A相）和去离子水（B相）作为流动相的洗脱溶剂，选取梯度洗脱，在10 min 内可完成4种水溶性糖的出峰及分离，见图3。具体梯度洗脱程序见表1。此外，本实验还对漂移管温度和载气压力进行了优化，选取漂移管温度50 ℃，载气压力为30 psi时，色谱图基线平稳，噪声信号最小。

表1 UPLC梯度洗脱程序Tab.1 UPLC gradient elution program

图3 超高效液相色谱图Fig.3 UPLC chromatograms

2.5 工作曲线、相关系数、检测限和定量限

制备系列浓度为4 μg/mL-1000 μg/mL的4种糖的混合标准溶液，按1.3的色谱条件进行分析。以目标物峰面积(Y)对标准工作溶液的质量浓度(X)进行对数线性回归，其线性回归方程、相关系数、检出限、定量限、回收率和精密度如表2所示。该本方法灵敏度较高，适合于定量分析。

2.6 方法比较

和烟草行业标准方法（YC/T 447-2012）[11]和汤建国等[6]的方法相比，本实验方法因无需长时间振荡萃取或超声萃取，大大缩短检测时间或前处理时间，且本方法增加净化步骤，通过分散固相萃取剂的净化后，可以很大程度上减少色素、植物碱、蛋白质等干扰物质，从而降低色谱柱污染及色谱基线，增加检测灵敏度。

2.7 实际样品的测定

选取对贵州省12个烟叶样本，分别利用烟草行业标准方法[11]（YC/T 447-2012）（方法1）和本实验方法（方法2）对烟叶样本中的4种水溶性糖含量进行了测定。每个样本平行测定3次，结果取平均值，见表3。两组方法所测结果较为一致。表明此方法可用于样品烟叶中水溶性糖的准确测定。

表2 烟草中4种水溶性糖的回归方程、决定系数、检测限和定量限Tab.2 Regression equations ,coefficients of determination, limits of detection and quantification of 4 water-soluble sugars in tobacco

表3 烟叶中水溶性糖的含量Tab.3 Contents of water-soluble sugar in tobacco leaf mg/g

3 结论

本文通过对样品提取、色谱等条件的优化，建立了一种DSPE–UPLC/ ELSD快速测定烟草中的4种水溶性糖含量的方法。该方法简便、快速、灵敏度高，采用分散固相萃取净化后，减少色素等化合物的干扰，有效降低样品对色谱柱的污染。本方法适用于大批量烟草中4种水溶性糖的快速测定，为烟叶质量评价提供技术支持。