miR-200b对三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231的负性调控作用

刘 棣，张寅斌，闫婉君，赵小瑶，盛倩文，许 朋，管海涛，张淑群

(西安交通大学第二附属医院肿瘤科，陕西西安 710004)

乳腺癌的全球发病率在女性患者恶性肿瘤发病中居首位，是常见的恶性肿瘤[1]。三阴性乳腺癌是乳腺癌中较特殊的类型，缺少激素受体、表皮生长因子受体表达，侵袭转移能力较强，恶性程度高，目前缺乏有效的治疗手段[2-4]。因此，需要进一步研究三阴性乳腺癌的发病机制及生物学行为，寻找新的靶点。近年来，对乳腺癌发病机制的研究转向了微小RNA(microRNA, miRNA)，它是非编码的单链RNA，含有18～25个核苷酸序列，在人类发育、细胞增殖、凋亡及激素分泌等多种生理过程发挥重要作用。研究表明，miR-200在多种肿瘤中异常表达[5-6]，而对于其在乳腺癌中的作用及功能机制仍存在争议[6-7]。本研究通过检测miRNA-200b在各种分子分型乳腺癌细胞中的表达，以及它对三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭等能力的影响，探讨miR-200b在三阴性乳腺癌发生、发展过程中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞株及试剂人乳腺癌细胞株MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、SKBR3、MDA-MB-468、MDA-MB-231来自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；RPMI 1640培养基为Hyclone公司产品，miR-200b mimics、miR-200b inhibitor、negative control来自Dharmacon公司；引物由华大基因公司合成，RT-PCR相关试剂来自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及RNA提取 在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中进行细胞培养。采用Trizol提取总RNA。

1.2.2定量PCR检测乳腺癌细胞miR-200家族表达量 定量PCR采用SYBR试剂盒进行。反应体系50 μL，95 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 78 ℃ 20 s，共40个循环，收集反应数据。U6 snRNA作为内参。

1.2.3细胞转染 因为既往对miR-200b的研究不甚清楚，所以选取miR-200家族中的miR-200b进行实验。取MDA-MB-231细胞(5×104/L)接种于6孔细胞培养板(2×105/孔)，分别以miR-200b mimic，inhibitor，negative control转染细胞。以无血清RPMI 1640培养基洗涤2次，加入100 mL/L胎牛血清的培养基继续培养24 h。

1.2.4克隆形成实验 6孔细胞培养板常规培养细胞(200个细胞/孔)，含100 mL/L FBS的RPMI 1640培养基培养。5 g/L结晶紫在室温下染色1 h。计数每板克隆形成数量，计算克隆形成效率(colony forming efficiency, CFE)。

1.2.5四唑盐比色法(MTT)检测转染后MDA-MB-231细胞的增殖能力 取细胞5×104/L，铺96孔细胞培养板中(100 μL/孔)，分别在转染后24、48、72 h进行MTT检测。酶标仪检测吸光度。

1.2.6细胞转移、侵袭实验 采用transwell小室，预铺Matrigel，取5×104/L的细胞接种于小室的上层，加不含FBS培养基。含100 mL/L FBS的培养基加入小室下层。24 h后以结晶紫染色，显微镜下计数细胞。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0统计软件对相关数据进行分析。两组均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1乳腺癌细胞miR-200家族的表达Trizol法提取totalRNA，Real-time PCR检测各种分型乳腺癌细胞株中miR-200a/b/c的表达。结果显示，分别与MDA-MB-231和MDA-MB-468组相比，miR-200a/b/c在MCF-7、BT-474、MDA-MB-453组中均处于高表达水平(P<0.05，图1)。miRNA-200家族在Luminal型和Her-2表达型乳腺癌细胞中的表达量高于三阴性型的表达(P<0.05，图1)。miR-200家族在三阴性乳腺癌中的表达较为特殊。

图1乳腺癌细胞中miR-200a/b/c的表达情况

Fig.1 The expression ofmiR-200a/b/c in breast cancer cell lines

与MCF-7、BT-474、MDA-MB-453组比较，*P<0.05。

2.2miR-200b对克隆形成率的影响研究显示，miR-200家族对肿瘤侵袭转移的作用存在较多分歧，而对miR-200b的研究较少，所以本研究选取miR-200b在三阴性乳腺癌细胞中做进一步研究。转染miR-200b inhibitor和mimics后，检测各组细胞克隆形成情况。与control组相比，inhibitor组MDA-MB-231的克隆形成率增高(P<0.05)。而与control组相比较，miR-200b mimics组肿瘤细胞克隆形成率降低(P<0.05，图2)。

2.3miR-200b对细胞增殖的影响在MDA-MB-231细胞中，通过inhibitor下调miR-200b表达，与negative control(NC)组相比，inhibitor组在48 h和72 h时，细胞增殖增高(P<0.05，图3)。通过miR-200b mimics上调miR-200b表达后，miR-200b组在48 h、72 h时，细胞增殖降低(P<0.05)。

图2miR-200b对细胞克隆形成率的影响

Fig.2 The influence of miR-200b on MDA-MB-231 cell colony formation (NC：negative control)

A：miR-200b抑制剂对MDA-MB-231克隆形成率的影响；B：miR-200b mimics对MDA-MB-231克隆形成率的影响。与NC组比较，*P<0.05。

图3miR-200b对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响

Fig.3 The effect of miR-200b on MDA-MB-231 cell proliferation (NC: negative control)

A：miR-200b抑制剂对MDA-MB-231细胞增殖的影响；B：miR-200b mimics对MDA-MB-231细胞增殖的影响。与NC组比较，*P<0.05。

2.4miR-200b对细胞侵袭力的影响通过transwell小室方法，检测miR-200b对三阴性乳腺癌细胞侵袭力影响。和control组对比，miR-200b inhibitor组的细胞数增多(P<0.05)。而miR-200b mimics组的细胞数量少于对照组(P<0.05，图4)。提示miR-200b能抑制MDA-MB-231细胞株的侵袭能力。

图4miR-200b对细胞侵袭力的影响

Fig.4 The effect ofmiR-200b on cell invasion (NC：negative control)

A：miR-200b抑制剂对MDA-MB-231细胞侵袭力的影响；B：miR-200b mimics对MDA-MB-231细胞侵袭力的影响。与NC组比较，*P<0.05。

3 讨 论

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁女性健康。三阴性乳腺癌(ER、PR和Her-2均为阴性)是乳腺癌中的一个类型，其发病年龄低、恶性程度较高、预后较差，临床实践中除了化疗，缺少其他有效的治疗手段[2-4]。三阴性乳腺癌多因短期内复发、转移而治疗失败。因此，针对三阴性乳腺癌的相关研究，一直是临床肿瘤领域的热点问题。

作为近来发现的miRNAs，它对肿瘤的调控作用，越来越受到重视。通过研究miRNAs对乳腺癌的影响，以及通过调控miRNAs来靶向调控肿瘤细胞的生长，是目前研究的新方向，也是较有希望的治疗模式。已有研究发现，不同的miRNAs与乳腺癌内分泌治疗耐药相关，其中miR-200家族与雌激素受体拮抗剂(fulvestrant)密切相关[8]。既往研究表明，miR-200在多种肿瘤中异常表达[5-6]，miR-200家族对肿瘤的侵袭转移方面作用的报道存在较多争议[6-7,9-10]。KORPAL等[11]研究发现，上调miR-200表达后，乳腺癌脑转移的发生率明显增高[11]。CHOI[12]的研究发现，在三阴性乳腺癌细胞中上调miR-200a/200b/429或miR-141/200c，都会抑制癌细胞增殖，促进细胞侵袭转移，其中miR-141/200c能够更高效地在三阴性乳腺癌中分泌VEGF-A激活FAK/PI3K/AKT信号通路，从而抑制细胞的侵袭转移。而PERDIGAO-HENRIQUES[10]的研究显示，miR-200c抑制TGF-β/BMP信号通路，促进表皮基因表达，从而通过调控基因表达网络来抑制细胞的侵袭力。有研究表明miR-200抑制三阴性乳腺癌的远处转移[9,13]。由此可见，miR-200家族在肿瘤细胞，尤其是三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭转移中的作用还存在不同的意见[13]，有必要进一步研究。

本研究针对miR-200家族在三阴性乳腺癌细胞中的作用进行分析，发现miR-200a/b/c在不同分子分型的乳腺癌细胞中的表达水平存在差异，三阴性乳腺癌细胞的表达明显低于Luminal型和Her-2型乳腺癌，表明miR-200a/b/c的调控网络在三阴性和非三阴性乳腺癌中存在差异[14,8]。我们进一步研究了miR-200b在三阴性乳腺癌侵袭转移方面的作用，通过上调低表达的miR-200b，发现三阴性细胞MDA-MB-231的侵袭能力被抑制。miR-200b具有抑制肿瘤细胞增殖、克隆形成以及侵袭力的作用。由此可见，miR-200b在三阴性癌细胞株MDA-MB-231中发挥抑癌作用，miR-200与ER、PR、Her-2分子的关系，以及miR-200在不同分子分型乳腺癌的调控网络及其下游复杂的信号通路有待进一步阐明。近年来的研究结果，miRNAs可能成为有希望的肿瘤诊断、治疗手段。结合既往miRNAs在恶性肿瘤中的研究[15]，miR-200b被认为可能作为三阴性乳腺癌治疗的潜在靶点，为其治疗提供新的思路。