长期有氧运动对老年大鼠骨组织维生素D受体表达的影响*

王 兵,侯 俊

(1.西安工业大学 体育学院,西安 710021；2.洛阳师范学院 体育学院,洛阳 471022)

骨质疏松是一类以骨质丢失、骨小梁数量减少和骨微结构退化为特征的代谢性疾病[1],好发于中老年人群体.通常情况下,骨质疏松的症状并不明显,直至骨折的发生.骨质疏松导致的骨折主要发生在脊椎、股骨近端和前臂远端等[2],这些部位又属于身体承受力量较为突出的部位.骨质疏松性骨折的高致残率和致死率给社会经济带来沉重的压力.年龄是骨质疏松和相关骨折发生的一个重要的独立的风险因子，随着衰老的进程,骨质疏松发生的概率明显增加[3].中国是世界上老龄化最严重的国家之一.根据国家统计局《2014年国民经济和社会发展统计公报》,2014年中国13.67 亿人口中,60岁以上的人口数目占总人口比例为15.5%；而65岁以上人口数目占比达到10.1%.而中国的老龄化进程速度更是世界第一[4].一项meta分析调查发现在过去的12年里,中国骨质疏松的发生率明显增加(在2008年之前为14.94%,而在2012-2015年里发生率增加至27.96%)；目前50岁以上老人的骨质疏松发生率已经达到2006年的1.5倍[5].大量的研究报道说明维生素D的缺乏是造成骨质疏松最为危险的要素之一.与此同时,有大量的临床证据显示，长期有氧运动训练相比药物治疗,因为其经济性和安全性,可以显著增加老年人群的骨质,减少骨质疏松以及相关骨折的发生[6-8].然而长期有氧运动训练骨保护作用的分子机制仍然不清,因此，该领域的研究目前是运动医学领域目前最为关注的话题之一.

原发性骨质疏松症是一种慢性、进行性的以骨量减少和骨微结构破坏为特征,易导致一些常见部位,例如椎体、髋部以及腕部发生脆性骨折的疾病,是体内外多种因素共同作用的结果,但是老龄化是主要的诱因.以往研究主要关注更年期妇女常见的绝经后雌激素缺乏引起的骨质疏松症,然而近年来发现男性原发性骨质疏松症患者比例日益增高.如何通过有效地非药物性手段介入成为研究关注的重点.维生素D为固醇类衍生物,体内维生素D主要来源于食物补充或者通过皮肤中7-脱氢胆固醇经紫外线照射生成,经过一系列羟基化等作用最终生成维生素D的活性形式1,25-(OH)2D3[9].该研究成果目前已经得到同行专家学者的广泛认同,并在重复性实验中得到有效的验证,但转化机理有待进一步的发掘.维生素D可以促进小肠对钙的吸收,从而维持体内钙离子的稳态[10].根据大多数实验及上述实验研究成果,小肠是钙离子吸收最为积极和有效的场所,但是对于其他部位的钙离子吸收能力及吸收效能并没有详细的阐述,所以该领域的研究亟待发掘和实验佐证.维生素D还可以促进骨组织对钙和磷的吸收,促进骨骼的矿化[11].这说明维生素D水平与骨密度关系密切,当体内维生素D水平不足时可导致骨密度降低.但维生素D不能直接发挥作用,需要通过其生物活性物质1,25-(OH)2D3的与其核受体VDR结合完成[12].1,25-(OH)2D3/VDR信号通路可以通过调节OPG,RANKL以及Wnt/β-catenin等通路来维持骨组织的健康[13].所以单纯的维生素D能够促进骨骼生长发育并提高骨密度并非直接作用结果,缺乏阳光作用,维生素D并不能在机体骨密度改善方面发挥主导作用.现有原发性骨质疏松症患者治疗的基本方式是摄入维生素D及钙制剂.但若伴有其他病理情况时,维生素D的摄入易导致过量等,因此，在药物以外寻求更为安全的方式成为临床实践的方向.大量研究表明,通过合理的运动可以提高原发性骨质疏松症患者的BMD,但其中的机制除了已被证实的生物力学刺激以外,是否还与维生素D水平有关?研究发现成年2型糖尿病大鼠经过适度的游泳训练可以增加大鼠血清中维生素D的水平[14].虽说实验结果可以有效地说明糖尿病大鼠通过游泳实验可以有效地提高体内维生素D的水平,但是糖尿病本身对于骨质疏松是否产生消极作用文章并没有实验对比,这也为后期进一步地实验研究预留了足够的空间,同时也为有氧运动对于糖尿病患者有益的相关研究提供了方向.VDR是类固醇激素受体家族当中的一员,他与1,25-(OH)2D3激素信号分子在靶细胞结合后形成相应复合物,该复合物再与视黄醛X受体形成杂二聚体后与维生素D受体反应元件结合,从而对靶基因的转录和翻译进行调控后实现生物学功能,主要调节钙和磷的代谢.研究表明，它是核内能够介导发挥生物效应的一种生物大分子,分布在机体的许多组织中,包括骨、肾脏、心脏和血管等.从现有研究成果来看,VDR基因多态性与人类的寿命和晚年健康密切相关[15].最近的研究显示，VDR可以通过调节klotho和成纤维细胞生长因子-23参与过早老化的过程调控[16-17].上述研究成果说明，VDR在维生素D的转化利用等方面发挥着积极的作用,并由此对骨骼的健康成长起到了积极的作用.文献[18]研究显示抗阻训练(不同于本文的耐力训练)可以在短时间内增加大鼠骨骼肌肌肉中VDR的表达；而短时间的耐力训练则对大鼠肌肉中VDR的表达没有明显改变.在成年2型糖尿病大鼠中,4周的适度游泳训练(另一种耐力训练)则可以增加肌肉中VDR的表达[14].

本文以老年大鼠为研究对象,观察长期有氧运动训练对老年大鼠骨质疏松治疗作用的同时,检测大鼠血液中维生素D的水平以及骨组织中维生素D受体的表达水平,观察长期有氧运动对老年大鼠维生素D通路的影响,尝试有效地说明维生素D在骨质疏松预防方面的作用机制,并尝试解释长期有氧运动“骨保护”作用的潜在机制.本研究则发现12周的递增强度跑台运动可以增加骨组织中VDR的表达.

1 实验对象与方法

1.1 动物和试剂

2月龄雄性F344大鼠(n=10)及23月龄雄性F344大鼠(n=30)(北京维通利华实验动物技术有限公司),定量RT-PCR检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),动物组织柠檬酸合酶活性检测试剂盒(比色法,上海杰美基因医药科技有限公司),1,25-(OH)2D3检测试剂盒(英国Immuno Diagnostic生物试剂公司).

1.2 运动方式

2月龄雄性F344大鼠做为年青对照组(Young).参考以往研究文献[7],有氧训练通过12周实验室自制大鼠用跑台完成.经过改良后的具体训练方案为：将大鼠放置于电动跑步机上,倾斜角设置为10°,训练强度递增.第1～2周,每天跑台运动0.5 h,速度设置为8 m·min-1；第3～4周,每天运动45 min,速度设置为12 m·min-1；第5～12周每天运动1 h,速度设置为20 m·min-1.

实验大鼠非运动年青和老年大鼠仅将其放置于跑台上,速度为零,放置时间与运动组大鼠的安排相同.23月龄雄性F344大鼠随机分为非运动组(Aged)和运动组(Aged+EX),按照运动方案持续有氧运动训练12周之后称量体重,“颈椎脱臼法”安乐死方式处死动物,动物处理符合相关的政策法规,实验全程保证最终取材的每组动物数目为9只.取材(股骨、椎骨)用于测量骨密度值.分离比目鱼肌,通过试剂盒检测肌肉中“柠檬酸合成酶”活性,用于评价长期有氧运动训练的效果.

1.3 骨密度的检测

剥离左侧股骨和椎骨,去除结缔组织和肌肉,使用DEXA双能X线骨密度仪检测大鼠股骨和L2-5段椎骨的骨密度.

1.4 实时定量RT-PCR检测

检测完骨密度的股骨和椎骨,置入研钵,加入液氮,然后将骨组织研磨粉碎,加入Trizol溶液提取总的RNA,应用随机引物反转录合成互补单链DNA,设置定量RT-PCR反应体系,维生素D受体(VDR)基因引物序列：上游5’-ACAGTCTGAGGCCCAAGCTA-3’；下游5’-CTGGTCATCGGAGGTGAGAT-3’.将GAPDH设为内参基因,引物为：上游5’-GAGCTGAATGGGAAGCTCAC-3’；下游5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGAGT-3’.ABI7500定量PCR仪检测,通过OpticonMonitorTMsoftware软件分析数据.最终结果以Young组的倍数表示.

1.5 血清中1,25-(OH)2D3(维生素D的活性形式)水平的检测

大鼠处死后,迅速通过腹主动脉放血收集血液,放置1 h,200 g离心分离出血清,-20 ℃保存.应用ELISA试剂盒检测血清中1,25-(OH)2D3水平.

1.6 统计分析

最终结果显示为平均值±标准差,组间显著性差异检验通过t检验完成,当P值小于0.05时,认为组间存在有统计学意义的差异.

2 结果与讨论

2.1 持续有氧运动训练对实验大鼠体重、肌肉柠檬酸合成酶及骨密度的影响

在VDR基因敲除小鼠中出现了许多过早老化的现象,包括存活率低下，过早脱发，皮肤变厚，表皮囊肿以及骨质疏松等[19].而且研究发现，VDR受体的数量随着年龄的增长而减少,这一点可能会降低老年人的肌肉力量,进而影响到骨骼的质量.另一方面,有研究也发现，VDR数量减少伴随衰老出现的同时还有骨组织中VDR的表达也减少.实验结果(图1)表明：非运动训练状态下,老年(Aged)大鼠与青年大鼠(Young)相比,体重(图1(a))明显增加(用*表示：p<0.05),但比目鱼肌中柠檬酸合酶活性(图1(b))变化不明显,而股骨(图1(c))和椎骨(图1(d))的骨密度(BMD)则明显下降.与之不同的是,经过12周持续有氧运动训练(EX)的老年大鼠,尽管体重稍高于非运动的青年大鼠,但无统计学差异,而与非运动状态的老年大鼠比较,体重则显著下降,而且肌肉中柠檬酸合酶活性增加,股骨和椎骨的骨密度也明显增加(用#表示：p<0.05).

图1 持续有氧运动训练可以显著减轻衰老引发的骨质丢失

2.2 持续有氧运动训练对实验大鼠维生素D的水平的影响

实验采用血清中维生素D的生物活性形式1,25-(OH)2D3代表维生素D的营养状况.如图2所示,非运动训练状态下,老年大鼠与青年大鼠相比,血清中1,25-(OH)2D3水平(图2)明显降低(用*表示：p<0.05)；而经过12周持续有氧运动训练(EX)的老年大鼠,其血清中1,25-(OH)2D3水平与非运动状态的老年大鼠相比,呈现轻微增加,而无统计学意义.研究中发现，12周的跑台训练对老年大鼠血清中维生素D的水平并无显著影响,分析可能是不同的耐力运动形式,运动强度和运动时间及不同病理情况所导致.但实践中,对于老年患者来说,低强度的持续步行有氧运动训练方式更易接受.因而,为了探究持续有氧运动对骨质疏松症患者骨组织的保护机制,本文进行了进一步探索.

2.3 持续有氧运动训练对实验大鼠骨组织中维生素D受体(VDR)表达的影响

衰老条件下,随着1α羟基化的缺乏,1,25-(OH)2D3的合成减少[20]；以及体内1,25-(OH)2D3的分解代谢增加[21],从而体内1,25-(OH)2D3的水平减少.而1,25-(OH)2D3的减少也证实与骨质疏松性骨折的发生密切相关[22];人为地诱导维生素D缺乏也可以导致健康人骨出现衰老的现象,增加骨折的发生风险[23].

图2 持续有氧运动训练对维生素D的水平没有显著影响

从现有研究成果来看,1,25-(OH)2D3能够有效的促进成骨细胞的分化和增殖,同时促进碱性磷酸酶的活性和数量,Zanello和他的同伴通过实验发现,给小鼠进行人工喂养1,25-(OH)2D3,后期发现成骨细胞的离子通道活性发生变化[24],这说明1,25-(OH)2D3对于骨的形成发挥着积极的作用.体内维生素D 主要通过其活性形式1,25-(OH)2D3与VDR结合发挥作用.如图3所示,非运动训练状态下,老年大鼠与青年大鼠相比,股骨(图3(a))和椎骨(图3(b))骨组织中VDR的mRNA水平明显下降.而经过12周持续有氧运动训练(EX)的老年大鼠,其股骨和椎骨骨组织中VDR的mRNA水平与非运动状态的老年大鼠相比明显增加.本文研究结果发现老年雄性大鼠血液中维生素D水平和骨组织中VDR的表达水平明显降低，提示老年男性原发性骨质疏松症的发生可能与维生素D营养状况及其作用发挥有关.

图3 持续有氧运动训练可以显著增加老年大鼠骨组织中VDR的表达

3 结 论

1) 非运动状态下,老年大鼠的股骨和椎骨的骨密度相较于青年大鼠明显下降；长期持续有氧运动训练可以增加老年大鼠的股骨和椎骨的骨密度,提示持续有氧运动训练可以显著减轻衰老引发的骨质丢失.非运动状态下,与青年大鼠相比,老年大鼠血清中1,25-(OH)2D3水平降低；长期持续有氧运动训练对之没有明显影响.非运动状态下,与青年大鼠相比,老年大鼠股骨和椎骨的骨组织中维生素D受体(VDR)表达明显降低；长期持续有氧运动训练可以增加老年大鼠的股骨和椎骨中VDR的mRNA表达.运动可以通过部分激活1,25-(OH)2D3/VDR信号通路,最终有助于减轻由于衰老诱导的骨质疏松,该研究至少部分解释了在衰老性骨质疏松中长期有氧运动骨保护作用的潜在分子机制.

2) 长期持续有氧运动训练上调老年大鼠骨组织中维生素D受体的表达,该结果可以部分解释长期持续有氧运动训练对老年大鼠骨组织保护机制.鉴于运动对老年大鼠体内维生素D的水平没有明显影响,提示可以通过给予外源性维生素D补充配合运动疗法,来促进骨的生长,从而起到更好的骨保护作用.

3) 应该考虑到不同的运动模式对老年大鼠骨组织维生素D受体表达的差异性,在老年大鼠的研究成果基础上,为获得老年人群运动模式转变对身体素质及体质发展的相关研究成果提供了目标和方向.