OSAHS患者体内循环血内皮细胞凋亡相关机制研究-内质网应激通路

杨媛媛，李凯，夏坤刚 ＊

（寿光市人民医院 呼吸内二科，山东 寿光 262700）

0 引言

OSAHS是并发冠心病、动脉粥样硬化和卒中等心血管疾病的高危因素[1-2]，间歇缺氧是OSAHS核心的病理生理机制[3]。循环血内皮细胞（CECs）是直接反应血管内皮损伤的指标，而内皮细胞损伤是心脑血管疾病的重要始动因素[4-5]。该课题通过研究OSAHS体内CECs凋亡情况，并试图探讨其中可能的凋亡通路。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）主要试剂。AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR反应试剂盒（TaKaRa公司，日本）、抗体BIP、CHOP、caspase12（Abcam，美国），其他化学试剂均为国产分析纯。

（2）主要仪器。ALICE4多导睡眠监测仪、实时荧光定量PCR仪（ABI 7500 Real time PCR system，美国）。

（3）研究对象。①病例组：所有病例组病例均来自2017-04至2018-04因“夜间打鼾”就诊于寿光人民医院门诊的病人，经PSG确诊的有158例，其中符合条件入选的有39例，自愿参加该研究的有30例，所有入选病人行PSG检测前均详细记录患者年龄、性别、身高、体重、BMI等。②对照组：来自同期寿光人民医院查体中心的健康志愿者，主诉无打鼾病史，年龄、性别、身高、体重、BMI等与病例组匹配，并行PSG检测排除OSAHS并自愿加入本研究者30例。

（4）入选标准：按2003年中华医学会呼吸分会睡眠呼吸疾病学组制定的标准，OSAHS是指每晚7小时睡眠中，阻塞性呼吸暂停反复发作30次以上或者AHI大于等于5次/h。

（5）排除标准：①合并高血压、冠心病、急性心脑血管事件患者；②合并糖尿病、血脂代谢异常患者；③合并COPD、支气管扩张、间质性肺病等其他引起呼吸功能障碍患者；④合并其他睡眠障碍疾病患者等。

1.2 研究方法

（1）实验步骤。①嘱受试者当天清淡饮食，忌咖啡、浓茶、饮酒，连续7 hPSG检测。②受试者完成PSG检测后，次晨空腹抽取静脉血，化验肝功、肾功、血糖、血脂、BNP等指标，另抽取4 mL抗凝血分离PBM层细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，realtime PCR检测BIP、CHOP、caspase12表达情况。③受试者均接受CPAP治疗3月，重复检测上述步骤。

（2）实验方法。①PSG检测：受试者的PSG检测时间为10PM至次日凌晨6AM，连续监测时间不小于7 h，监测内容包括鼾声、脑电、肌电、眼电、手指末端血氧饱和度、心电、鼻气流，PSG检测结果为同步实时显像同时电脑储存回放采集。②流式细胞学检测循环血内皮细胞凋亡率：受试者次晨起（06∶30-07∶00）抽取静脉血，前2 mL弃置不用，已避免抽血不当造成误差，4 mL抗凝后使用Ficoll液分离各层细胞，分离PBMC层，均分为两管（A管、B管）。A管洗涤离心后PBS稀释，在计数板上计数，调整细胞浓度至1×107cells/mL，CECs细胞在其中，按照流式细胞仪检测凋亡细胞步骤操作。③real-time PCR法检测内质网应激活化标志因子BIP，及凋亡通路活化因子CHOP、caspase12：②步骤中B管细胞按照Trizol一步法提取细胞总RNA，超微量分光光度计测定RNA纯度和含量。按照逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA，实时荧光定量PCR反应按照说明书步骤进行，PCR反应所用引物如下：H-actin5’-3’CGTTGACACCGTAAAGACCTC，3’-5’T A G G A G C C C A G G G C A G T A A T C T；B I P 5’-3’A A G G G G A G C G T C T G A T T G G，3’-5’CCTCGGCAGTTTCCTTCATTT；CHOP5’-3’TCTGCCTTTCGCCTTTGAG，3’-5’GCTTTGGGAGGTGCTTGTG；caspase12 5’-3’GCCAATTCCGACAAACAGC,3’-5’GCCACTCCAACATTTACCTCC。SYBR GreenⅡ 法进行实时荧光定量PCR反应，每个样本重复3次，2-△△CT法进行mRNA水平定量分析。

1.3 统计学分析

所有数据用SPSS 18.0统计软件分析处理，组间差异用单因素方差分析进行显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入组受试者一般情况，详情见表1

病例组30例，男女比例为24/6，年龄36-78岁，平均（52.39±10.78）岁，体重指数在22.15-32.72 kg/m2，平均（28.65±2.61）kg/m2之间；对照组30例，男女比例23/7，年龄33-71岁，平均（49.45±6.90）岁，体重指数在23.11-33.65 kg/m2之间，平均（27.31±2.94）kg/m2；经SPSS 18.0统计软件分析结果如“表1”所示，两组间年龄、体重指数P值＞0.05无明显差异，具有可比性。所有研究对象均经PSG检查确诊或者排除OSAHS，均通过询问病史常规化验检查等方式排除糖尿病、高血压、心力衰竭、支气管扩张或者COPD等影响因素。

表1 病例组和对照组一般情况比较

2.2 流式细胞学检测循环血内皮细胞凋亡情况

如下图1、图2所示，相对于对照组（NC组，AI=2.36±0.24）， 病 例 组（IH组，AI=11.71±1.68）循环血内皮细胞凋亡率增加（P＜0.01）；使用CPAP治疗3月后，病例组（IH+CPAP组，AI=9.65±1.38）循环血内皮细胞凋亡率降低（P＜0.05）。

图1

2.3 real-time PCR法检测BIP、CHOP、caspase12

图2

如下表2、图3所示，相对于正常对照组（NC组），病例组（IH组）BIP、CHOP表达明显增高，caspase12表达增高不明显，使用CPAP治疗3月后，IH+CPAP组较IH组，BIP、CHOP表达均明显下降。

表2 内质网应激相关因子表达情况（±s）

表2 内质网应激相关因子表达情况（±s）

注：＊相对于NC组P＜0.01，＃相对于NC组，P＞0.05，&相对于IH组P＜0.05。

内质网应激相关因子BIP、CHOP、caspase12表达情况（2-△△CT）NC 组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 IH组 5.26±1.39＊ 11.55±2.01＊ 1.32±0.36＃IH+CPAP 组 3.18±0.97& 4.23±0.43& 1.19±0.27分组图3

3 讨论

研究证实，OSAHS是动脉粥样硬化等心脑血管疾病的独立危险因素，然而其中的机制尚未明了。本室通过研究OSAHS患者体内循环血内皮细胞凋亡情况，探索OSAHS并发动脉粥样硬化等心脑血管疾病可能的相关机制。

相对于NC组，IH组循环血内皮细胞（CECs）凋亡率增加，经3月CPAP治疗后，凋亡率较前下降；国外的实验也证明了这点[6]。内皮细胞凋亡会影响内皮细胞功能，从而对动脉粥样硬化的发生、发展产生深远的影响[7]。

目前针对细胞凋亡的研究主要集中在线粒体通路、死亡受体通路，是通过细胞内一系列复杂而精细的机制调控的，近年来，研究证实，内质网应激通路（又名内质网相关死亡通路ERAD）可能是细胞凋亡又一重要途径[8]。以往的研究证实，7-酮胆醇[9]通过触发内质网应激、CHOP表达诱发主动脉平滑肌细胞凋亡。本研究主要探索内质网应激通路在OSAHS诱导内皮细胞凋亡过程中的作用及主要的凋亡通路。

BIP是内质网应激（ERS）启动的标志性蛋白，CHOP、caspase12是内质网应激诱导细胞凋亡过程中最常见的凋亡通路[10]，据real-time PCR结果表明， IH组相对于NC组BIP、CHOP表达增高，经3月CPAP治疗后，IH组BIP、CHOP表达下降。而相对于NC组，IH组caspase12表达增高不明显，经CPAP治疗后，caspase12表达下降趋势不明显。实验证实，CHOP变化趋势与循环血内皮细胞凋亡趋势一致，说明内质网应激CHOP凋亡途径可能是引起循环血内皮细胞凋亡的一条重要通路。

综上所述，OSAHS患者体内循环血内皮细胞凋亡率增加，内质网应激CHOP通路可能是其中可能的凋亡通路。众所周知，内皮细胞结构完整是内皮细胞功能稳定的基础，内皮细胞功能不稳定可能是心脑血管急性事件发生的重要因素。我们希望，通过抑制内质网应激通路减轻缺氧条件下内皮细胞细胞凋亡会给OSAHS并发心血管并发症的治疗提供新的思路。