酵母种类及营养剂用量对霞多丽葡萄酒中氨基甲酸乙酯产量的影响

王根杰，李德美*，张亚东，辛 闻，王宗义

（北京农学院 食品科学与工程学院，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）天然存在于大多数发酵食品如面包、牛奶等和酒精饮料（啤酒、白酒、葡萄酒等）中[1]。

早在20世纪70年代，有学者发现EC具有潜在的致癌作用[2]。在葡萄酒酿造过程中，酵母代谢精氨酸产生尿素，当尿素产量过高时，会从酵母细胞内释放到葡萄汁中，与发酵产生的乙醇结合生成EC，这也是产生EC的主要途径。在酒精发酵过程中，酵母优先利用的氮源为铵态氮、游离α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，统称为酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）[3]。而葡萄汁中的YAN含量主要与土壤中的铵态氮含量有关[4]。

近年来，随着我国国民生活水平的不断提高，葡萄酒的消费量也日益增长。据有关研究报道，我国预计在2020年将成为世界第二大葡萄酒消费国[5]。然而，我国目前还没有规定葡萄酒中的EC限量标准，葡萄酒质量安全仍然存在很大的隐患。

目前国内对于葡萄酒中EC的研究主要多为尿素、精氨酸、瓜氨酸等对葡萄酒中EC含量的影响，以及发酵温度、贮存温度、乳酸菌等对葡萄酒中EC含量的影响[6-8]。本试验的葡萄园地属延怀河谷，土壤较为贫瘠，土壤缺氮较为严重[9]。因此在葡萄酒发酵过程中需要补充一定的氮源保证发酵顺利进行。然而，酵母营养剂的用量对EC产量的影响，且EC产量的变化规律及不同酵母对EC产量的影响研究也相对较少。因此，本试验采用稳定同位素稀释-液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中的EC含量，研究了葡萄酒酿造过程中不同酵母和不同酵母营养剂用量对葡萄酒中EC产量的影响，同时阐明葡萄酒中EC的含量与葡萄园土壤和葡萄汁中的氮含量之间的关系，为实际生产提供参考，同时为我国制定葡萄酒中EC限量标准提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒葡萄原料霞多丽（Chardonnay）、葡萄园土壤样品：河北怀来红叶酒庄；商业酿酒酵母（Saccharomyces cere visiae）X5、X16、RMS2、酵母营养剂（THIAZOTE）：法国Laffort公司；铵离子氮试剂盒（96 Assays per kit）、氨基酸态氮试剂盒（100 Assays per kit）：爱尔兰Megazyme International Ireland有限公司。

氯化钾、硝酸钾、氢氧化钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、次氯酸钠、酒石酸钾钠、硫酸铵（均为分析纯）：北京蓝弋试剂公司；甲醇、冰醋酸（色谱级）：美国Mreda公司；乙腈（色谱级）：韩国SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯（EC）标准品、氨基甲酸乙酯内标化合物（EC-d5）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV9100双波长紫外分光光度计：北京Lab-Tech公司；6410 Triple Quad液相色谱-串联质谱仪（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）（配化学工作站软件B.02.01版）：美国Agilent公司；HealForceRSuperSeries NW超纯水系统：上海Canrex分析仪器有限公司；MS3基本型涡旋混合器：德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集

本研究以河北怀来红叶酒庄2016年霞多丽葡萄为实验材料。采收当天，根据标准对葡萄园的1-1、1-2和1-3三个葡萄地块进行土样的采集、处理和贮存，测定土壤中的铵态氮含量。葡萄采样结束后，尽快送到实验室进行压榨与澄清处理，同时取葡萄汁（含糖量265 g/L、酸度（酒石酸计）为8.68g/L、pH值为3.20、葡萄汁初始密度为1.098）样品，贮存于-20℃低温冰箱待测。

1.3.2 霞多丽葡萄酒的发酵工艺及操作要点

按照干白葡萄酒发酵工艺进行，不进行苹-乳发酵，霞多丽葡萄酒工艺流程如下：

操作要点：

（1）葡萄酒在除梗破碎过程中添加SO2（30 mg/L偏亚硫酸钾），减少原料的氧化。

（2）葡萄原料经过压榨后，在10℃以下低温澄清24 h。

（3）酵母菌接种量为0.2g/L，温度范围控制在15～20℃，在酒精度、还原糖含量基本不变时终止发酵。

（4）发酵期间温度范围控制在15～20℃。发酵前期、中期阶段，每12 h监测温度、密度；发酵末期阶段，每8 h监测温度、密度。

1.3.3 方案设计

酵母种类的影响：选用生产常用的商业酵母X5、X16、RMS2研究发酵过程中不同酵母对EC产量的影响。根据酒庄实际生产，酵母菌接种量和酵母营养剂THIAZOTE添加量均为0.2 g/L。酵母接种前需要在37℃左右水温中活化20～30 min。

酵母营养剂用量的影响：本试验以酵母X16（酒庄发酵霞多丽葡萄酒的酵母）接种量为0.2 g/L进行酵母营养剂不同用量对葡萄酒中EC产量影响的研究，酵母营养剂用量为0、0.3g/L、0.6g/L，以下分别记为YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6个处理均设置3次重复，共18个发酵单元。分别在发酵初期阶段（密度为1.090）、中期（密度为1.040）和末期阶段（密度为1.010）取样测定葡萄酒中的EC产量。

1.3.4 指标测定与方法

（1）土壤中铵态氮含量的测定[10]

土壤中铵态氮（NH4+-N）含量的测定采用氯化钾（KCl）浸提-靛蓝比色法，其计算公式如下：

式中：C为显色液铵态氮的含量，μg/kg；V为显色液体积，mL；ts为分取倍数；m为土样的质量，g。

（2）葡萄汁中酵母可同化氮的测定[11]

采用试剂盒检测氨基酸态氮和铵离子氮含量，计算公式如下：

ΔA=（A1-A2）样-（A1-A2）空白

式中：X1为氨基酸态氮含量，mg/L；V为终体积，mL；MW为氮摩尔质量，g/mol；ε为氮素在波长340 nm处的消光系数；d为光路距离，cm；v为样品体积，mL。

ΔA=（A1-A2）样-（A1-A2）空白

式中：X2为铵离子氮含量，mg/L；V为终体积，mL；MW为氮摩尔质量，g/mol；ε为氮素在波长340 nm处的消光系数；d为光路距离，cm；v为样品体积，mL。

可同化氮含量（mg/L）=X1+X2

（3）葡萄酒理化指标的测定[12]

根据国标GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》中的直接碘量法测定葡萄酒中游离SO2和总SO2的含量。

（4）葡萄汁或葡萄酒中EC含量的测定

采用稳定同位素稀释-高效液相色谱-串联质谱法[13]测定葡萄汁及葡萄酒中EC含量。

样品前处理：将酒样摇匀，立即准确取出1.00 mL于5 mL试管中，准确加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5内标工作液，旋涡振荡5 s，吸取样液过0.22 μm滤膜，待分析。

高效液相色谱（high efficiency liquid chromatography，HPLC）条件：XSELECT HSS T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Zorbax Eclipse Plus-C18预柱（12.5 mm×2.1 mm，5μm）。柱温为40℃，进样体积为10μL，流速为0.3mL/min；流动相A为0.1%（V/V）乙酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱顺序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Procedures of gradient elution

质谱条件：电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）正离子模式，多反应离子监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式监测，MRM参数见表2。干燥氮气温度为120℃，流速为10L/min；雾化器压力20psi；喷雾毛细管电压4000V。

表2 MRM参数Table 2 Parameters of multiple reaction monitoring

1.3.5 数据统计分析

数据处理与分析采用SPSS22.0，对葡萄酒中的理化指标进行多重比较分析，酒精发酵过程中的温度密度变化趋势图和EC产量图分别用Origin 9.0和Excel绘制。

2 结果与分析

2.1 葡萄园土壤和葡萄汁中的氮含量与葡萄酒中的EC含量关系

葡萄酒发酵过程中酵母代谢精氨酸产生的尿素与乙醇结合是生成EC的主要途径。由此可见，葡萄汁中的精氨酸是EC的主要前体物质之一。氨基酸是葡萄酒发酵所需的重要氮源，而YAN含量是衡量葡萄汁中氮源是否充足的重要指标。本试验研究了土壤中和葡萄汁中的氮含量与葡萄酒中的EC含量关系，结果见表3。

表3 葡萄园土壤和葡萄汁中的含氮量、葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量Table 3 Nitrogen contents in soil and grape juice,and ethyl carbamate contents in wine

由表3可知，不同葡萄园地块土壤中的铵态氮含量、葡萄汁中的YAN含量和葡萄酒中的EC含量均不同。土壤中的铵态氮含量越高，葡萄汁中的YAN含量越高，最终葡萄酒中的EC含量也相对越高。此外，可以看出葡萄酒中的EC含量均在5 μg/L以下，含量较低，这可能与最初土壤中的铵态氮含量较低有关。

2.2 葡萄酒中主要理化指标的含量

酒精发酵结束后，葡萄酒经自然澄清后，与酒泥分离，经过澄清、过滤、装瓶，置于瓶储室（温度在15～20℃，相对湿度在65%～70%）贮存3个月后取样。检测葡萄酒中的理化指标含量，结果见表4。

表4 霞多丽葡萄酒中理化指标检测结果Table 4 Detection results of physicochemical indexes of Chardonnay wine

由表4可知，葡萄酒指标含量均在正常范围内，符合葡萄酒国标要求。说明葡萄酒发酵过程控制合理，葡萄酒状态良好，满足葡萄酒中EC含量测定对酒样的要求。

2.3 发酵过程中酵母种类对葡萄酒中EC产量的影响

酵母是葡萄酒发酵过程中的重要因素，不仅会对葡萄酒的外观、香气和口感产生重大影响，同时也会产生大量微量的代谢产物[14]。随着发酵的进行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越来越少，酵母菌开始代谢精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代谢产生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒体中，与已积累的乙醇反应生成EC[15]。

发酵过程中不同酵母对霞多丽葡萄酒中EC产量的影响见图1。由图1可知，所研究的3种酵母的EC产量存在一定的差异。在发酵过程中，3种酵母的EC产量均呈逐步增长的趋势。在发酵初期阶段，酵母X16、RMS2和X5酿造的霞多丽葡萄酒中均有少量EC产生。在发酵末期阶段，3种酵母酿造的葡萄酒中EC产量均达到较大值。酵母X5、RMS2与X16相比，发酵末期阶段酿造的葡萄酒中EC产量分别增长了53.8%和17.6%，说明葡萄酒中的EC产量与酵母的菌种特性和氮代谢能力有关，这与于英等[15]研究结果一致。

图1 不同酵母种类在发酵过程中对葡萄酒中氨基甲酸乙酯产量的影响Fig.1 Effects of different yeast type on ethyl carbamate contents during wine fermentation process

2.4 不同酵母营养剂用量对葡萄酒中EC产量的影响

在酒精发酵过程中，酵母需要一定量的含氮化合物进行生长繁殖。否则，发酵会因氮源物质的缺乏而延缓甚至停滞[16]。酵母营养剂的成分主要是磷酸氢二铵，可以补充酵母所需氮源，加快发酵速率。而过量的磷酸氢二铵也会产生EC[17]。不同酵母营养剂用量对霞多丽葡萄酒中EC产量的影响结果见图2。

图2 不同酵母营养剂用量在发酵过程中对葡萄酒中氨基甲酸乙酯产量的影响Fig.2 Effects of different yeast nutrients addition on ethyl carbamate contents during wine fermentation process

由图2可知，在发酵初期阶段，添加酵母X16后，葡萄发酵液中未产生EC，可能与EC产量在检测限以下有关，也说明发酵初期阶段EC产量较低。在发酵中期阶段添加酵母营养剂后，酵母营养剂不同用量处理酿造的葡萄酒中EC产量与发酵前期阶段相比均有增长，且YN0.3、YN0.6均比对照组YNCK酿造的葡萄酒中的EC产量高。与发酵中期阶段相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在发酵末期阶段的EC产量分别增长了73.3%、95.0%、76.0%，表明酵母营养剂的使用有提高EC产量的风险。而在发酵末期阶段，酵母营养剂不同用量酿造的葡萄酒中的EC产量有一定的差异，与YNCK相比，YN0.3和YN0.6酿造的葡萄酒中的EC产量分别增加了12.8%、69.2%。结果显示，随酵母营养剂用量增加，酿造的葡萄酒中的EC产量增大。

2.5 葡萄酒中的EC含量

表5 不同处理葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量测定结果Table 5 Determination results of ethyl carbamate contents in wine with different treatments

由表5可知，不同发酵处理酿造的葡萄酒中的EC含量不同。酵母X5酿造的葡萄酒中的EC含量最高，X16酿造的葡萄酒中的EC含量最低。发酵末期阶段，各发酵处理酿造的葡萄酒中的EC含量均有所下降。这与朱亚楠等[18]测定葡萄酒新酒中的EC含量较低的结果相一致，且含量水平均低于10 μg/L，符合美国或欧盟的EC含量限定标准[19]。

3 结论

不同酵母和酵母营养剂不同用量对霞多丽葡萄酒中EC产量影响的研究结果表明，发酵过程中，不同酵母种类酿造的葡萄酒中的EC产量不同，最终酵母X5、RMS2和X16酿造的葡萄酒中EC含量分别为3.8μg/L、3.0μg/L和2.1μg/L。在本试验中，不同酵母酿造的葡萄酒中的EC产量之间无明显差异。不同酵母营养剂用量对霞多丽葡萄酒中的EC产量影响的研究表明，发酵过程中，随着酵母营养剂用量的增加，葡萄酒中的EC产量越大，说明酵母营养剂的添加有提高EC含量的风险。在发酵末期阶段，与对照相比，酵母营养剂THIAZOTE添加量为0.3 g/L和0.6 g/L酿造的葡萄酒中EC产量分别增加了12.8%和69.2%。葡萄酒发酵过程中，在酵母X16接种量为0.2 g/L的条件下，不添加酵母营养剂酿造的葡萄酒中EC产量相对最低。但在实际生产中，酵母营养剂的添加量要根据葡萄发酵液中的酵母可同化氮含量确定。在实验葡萄园现有的土壤氮素营养水平下，生产采用的酵母与酵母营养剂类型和用量，所酿造的葡萄酒EC产量范围为2.1～3.8 μg/L，均未超过美国或欧盟限量水平。

在本试验中，尽管采用不同酵母和不同酵母营养剂用量酿造的霞多丽葡萄酒中的EC产量之间差异较小，但是可以说明葡萄酒经过发酵后EC产量均处于较低水平。另一方面，本试验说明葡萄园土壤中的铵态氮含量会最终影响葡萄酒中的EC含量，因此对于氮肥的合理施用有一定的指导意义。此外，葡萄酒的品质不仅仅是由发酵过程决定的，还包括橡木桶陈酿、调配工艺、贮藏温度等因素。而这些因素也会对葡萄酒中EC含量产生影响，因此还需要结合起来进一步研究。