藻酸盐寡糖制备工艺及生物活性研究进展

蒋 越，姚子昂，陈丰嘉，彭宇鑫，吴海歌*

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁省海洋药物开发工程技术研究中心，大连海洋生物技术重点实验室，辽宁 大连 116622）

藻酸盐是细菌细胞壁及海带等褐藻类植物细胞壁的主要成分之一[1]，由β-D-甘露糖醛酸（mannuronic acid，M）和α-L-古洛糖醛酸（glucuronic acid，G）两种单体组成[2]。这些单体以3种不同的方式通过α-1,4糖苷键链接，从而形成一种无支链的线性嵌段共聚物[3]，分为聚β-D-甘露糖醛酸（polyM），聚α-L-古洛糖醛酸（polyG）和杂聚物（polyMG）[4]。其分子结构式如下：

其降解产物藻酸盐寡糖较藻酸盐相比具有分子质量低、水溶性好、易吸收等优点，其表现出多种生物活性而引起广泛关注，如抗肿瘤活性、抗凝血活性、降血压功能、免疫调节活性、促进植物生长等[5-10]。本文主要对近几年藻酸盐寡糖制备工艺及其生物活性进行概述，因此对其生物活性的研究对未来新药的开发和临床治疗奠定理论基础，且对不同领域的应用具有重要意义。

1 藻酸盐寡糖的制备

1.1 化学降解法

化学降解法是藻酸盐寡糖早期发现的传统的制备方法。其中酸降解法主要使用的有机酸有甲酸、草酸、无机酸、盐酸、硫酸。1966年，HAUG A等[11]在100℃条件下用浓度为1 mol/L草酸水解藻酸盐，约有1/3的藻酸盐溶解。通过调节pH（2.85）分离得到可溶和不可溶的两种组分，经过鉴定得知可溶组分80%～90%为甘露糖醛酸片段；不可溶组分80%～90%为古罗糖醛酸片段。LI H B等[12]还研究了氧化降解法作为藻酸盐寡糖的制备工艺，以H2O2为氧化剂，浓度为6%，调节pH为酸性环境，反应温度为60℃，反应时间为8 h，降解效率最高；在藻酸盐制备过程中，以正丁醇/甲酸/水（4∶6∶1，V/V）为洗脱液分离低聚糖，样品采用硅胶柱进行二次分离，质谱分析结果显示，聚合度为1 000～8 000 Da的寡糖基本得到分离。该方法较传统的酸降解法有污染排放少的优势。虽然化学降解法的成本低，技术也比较成熟，但存在的问题也十分明显，如反应剧烈，设备维护成本较高，特别是对环境的污染较为严重，且产量较低，致使化学降解法如今并不常用。

1.2 物理降解法

物理降解法主要是通过高温、辐射等方法降解藻酸盐，NAGASAWA N等[13]将藻酸盐固体和藻酸盐水溶液利用60Coγ射线处理，于20～500 kGy剂量范围内研究了γ射线对褐藻胶的影响。结果表明，藻酸盐水溶液降解程度明显高于直接处理固体藻酸盐。高度降解的藻酸盐伴随着颜色发生变化，该现象表明降解过程中在吡喃糖环中形成了双键。AIDA T M等[14]在2010年对藻酸盐进行水热处理（180～240℃）。结果表明，藻酸盐在高温条件下降解，藻酸盐被降解为藻酸盐寡糖、单糖、最终还产生了甲酸、乙酸、乳酸和羟基乙酸等有机羧酸。HU T等[15]将从藻酸盐水解产物中分馏的聚古罗糖醛酸溶解在稀氨水中，然后在微波辐射（1 600 W）条件下在130℃水解15 min以产生古罗糖醛酸寡糖混合物。通过Bio-Gel P6柱分离寡糖混合物，得到聚合度为1～10的古洛糖醛酸寡糖。之后通过电喷雾电离质谱、核磁共振氢谱（Hnuclearmagnetic resonance，H-NMR、核磁共振碳谱（C-NMR）和二维核磁共振谱（D-NMR）光谱技术进一步分析每个组分。结果表明微波降解法获得的寡糖的化学结构与酸水解法得到的寡糖化学结构相同，这种微波降解方法不仅方便，耗时少，环境友好，而且与常规酸水解法相比，还可以高产率（71%）制备古罗糖醛酸寡糖。物理法降解褐藻胶制备褐藻胶寡糖具有操作简单、反应迅速、无环境污染等优势，相比于化学法制备藻酸盐寡糖有非常明显的优势。

1.3 酶解法

藻酸盐裂解酶已从包括海洋藻类，海洋软体动物，以及多种微生物中发现，主要是以β消去机制裂解藻酸盐，在非还原末段形成双键，并在波长235 nm处有强烈的紫外吸收。根据裂解酶对底物的专一性来分可以分为Poly M酶、Poly G酶、Poly MG酶三种。ZHU B等[16]从新分离的海洋细菌粘质沙雷氏菌NJ-07中纯化出具有高比活性和pH稳定性的新型polyM特异性藻酸盐裂解酶AlgNJ-07。分子质量为25 kDa，并且在40℃、pH9.0条件下对海藻酸钠显示出2 742.5 U/mg的最大活性。此外，AlgNJ-07在8.0～10.0的pH范围内可保留95%以上的活性，表明其具有优异的pH稳定性，它还显示出对polyM嵌段的高活性和亲和力，并且对polyG嵌段没有活性，这表明它是严格的polyM特异性藻酸盐裂解酶。ZHU B等[17]在另一项研究中又从新分离的海洋菌株Cellulophagasp.中纯化出一种具有高活性（24 038 U/mg）的新藻酸盐裂解酶NJ-1。该酶在50℃和pH8.0下最具活性，并且在宽pH范围（6.0～10.0）和低于40℃的温度条件下保持稳定。它对海藻酸钠，杂聚MG嵌段（polyMG），均聚M嵌段（polyM）和均聚G嵌段（polyG）具有广泛的底物特异性，并且对polyG以及polyMG具有比polyM更高的亲和力和。降解产物的TLC和MS光谱分析表明它将藻酸钠完全水解成低聚合度（degree of polymerization，DP）的低聚糖。与化学降解法和物理降解法相比酶解法的反应条件更加温和，而且无论在产量还是环境友好方面都具有非常大优势，因此酶解法是如今降解藻酸盐的最常用且有效的方法。

2 藻酸盐寡糖生物活性

2.1 抗炎活性

ZHOU R等[18]研究了藻酸盐寡糖对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）诱导的神经炎症和小胶质细胞吞噬Aβ作用的影响。发现了在LPS/Aβ刺激之前用藻酸盐寡糖对Bv2小胶质细胞预处理后，可以显著抑制神经炎症的发生；并且除了对神经炎症的抑制作用外，研究还发现藻酸盐寡糖可通过与小胶质细胞中TLR4的相互作用促进对Aβ的吞噬作用。KIM M J等[19]利用酶解制备的藻酸盐寡糖对LPS诱导RAW 264.7细胞的抗炎作用进行研究发现，藻酸盐寡糖以剂量依赖的方式降低了一氧化氮的合成和促炎细胞因子的分泌，如肿瘤坏死因子，白细胞介素IL等产生。此外，在小鼠实验中，发现寡糖处理样品减少了小鼠耳水肿的形成。这些结果表明，褐藻胶寡糖具有优良的抗炎效果。

2.2 抗肿瘤活性

HU X K等[20]将藻酸盐裂解酶制备分子质量不同的藻酸盐寡糖，利用藻酸盐寡糖及其硫酸化的衍生物对tsFT210细胞作用，结果表明，两类物质对tsFT210细胞都不具有毒性作用；之后该实验使用了不同分子质量的藻酸盐寡糖及藻酸盐寡糖的衍生物直接作用于昆明小鼠，发现分子质量3 798 kDa且硫酸化程度为1.3的藻酸盐寡糖具有良好的抗肿瘤活性，且50 mg/kg藻酸盐寡糖对S180细胞的抑制效率为66.0%，100 mg/kg的和藻酸盐寡糖对S180细胞的抑制效率为70.4%。故通过该实验可判断藻酸盐寡糖及藻酸盐硫酸化衍生物可以通过调节机体的免疫系统从而间接的达到了抗肿瘤的目的。CHEN J等[21]使用藻酸盐裂解酶制备的藻酸盐寡糖，通过尺寸排阻色谱将寡糖进行分级，得到4种不同聚合度的寡糖命名为DP2、DP3、DP4和DP5，其中DP5对骨肉瘤细胞表现出抗肿瘤的功能。可以看出藻酸盐寡糖具有良好的抗肿瘤活性，在未来可以作为肿瘤治疗的潜在性药物，具有可观的发展前景。

2.3 抗菌活性

HOU W等[22]采用完全随机的方法，将863例细菌性阴道病患者分为甲硝唑治疗组，藻酸盐寡糖抗菌凝胶治疗组以及联合治疗组三组。从有效率、和不良反应发生率两方面评价，藻酸盐寡糖以高效率和低不良反应发生率表现出良好的抗菌作用。WU G F等[23]使用氧化降解的藻酸盐寡糖不同制备浓度加入MRS培养基中，并测试短乳杆菌49的抑菌作用以确定藻酸盐寡糖的抗氧化活性，结果表明，藻酸盐70℃，5%（V/V）H2O2和1.5 mg/100 mL作用制备的寡糖，具有最佳的抗菌效果，将不同浓度的低聚糖加入混合啤酒菌株的啤酒中，其中0.25 mg/100 mL的藻酸盐寡糖可以完全抑制啤酒细菌并防止啤酒的浑浊。TØNDERVIK A等[24]使用一系列致病真菌菌株评价藻酸盐寡糖干扰真菌生长和增强传统抗真菌药物的能力，包括念珠菌和曲霉菌，经光密度测定（OD600nm）藻酸盐寡糖培养的菌株细胞表现出明显的剂量依赖性（P＜0.005%），在生殖管测定中也显示出明显的抑制菌丝生长的效果。扫描电子显微镜和原子力显微镜结果均表明，藻酸盐寡糖（2%）显著破坏真菌生物膜形成，单独联合氟康唑。联合治疗组细胞表面粗糙度明显增加（P＜0.001）。高通量筛选表明藻酸盐寡糖具有对制霉菌素、两性霉素B、氟康唑、咪康唑、伏立康唑或特比萘芬的增效作用。ZHANG S等[25]发现藻酸盐寡糖浸泡后的种子种植后可以抗稻瘟病菌，藻酸盐寡糖可以诱导水稻植物细胞中苯丙氨酸解氨酶，过氧化物酶和过氧化氢酶的酶活性升高，保护植物免受入侵病原体的侵害。利用褐藻寡糖处理，稻瘟病菌引起的病害指数由17.74%降至10.81%，保护效力为39.06%。这些发现表明，藻胶寡糖可以作为生物制剂来控制稻瘟病。可见藻酸盐寡糖具有优良的抗菌活性，未来可作为抗菌药物，具有广阔的发展前景。

2.4 抗氧化活性

氧自由基在肿瘤、血栓的形成，以及肝炎、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的发生机理中都起到了重要的参与作用，因此使体内的过氧化状态降低对疾病的预防和治疗都具有重要的意义。FALKEBORG M等[26]用藻酸盐裂解酶制备藻酸盐寡糖的基础上进一步研究其抗氧化活性，结果表明，藻酸盐寡糖具有清除羟基和超氧化物自由基的活性。藻酸盐寡糖能够完全抑制（抑制率100%）乳浊液中脂质的氧化，其效果优于抗坏血酸（抑制率89%）。采用大肠杆菌法化和学发光法研究藻酸盐寡糖对3种自由基（O2-·、·OH和ABTS·+）的消除作用，发现分子质量小于1 000 kDa的藻酸盐寡糖对3种自由基都有较好的消除作用，消除效果与藻酸盐寡糖浓度成正比，而且寡糖的分子质量大小是影响自由基消除效果的重要因素。ZHANG M J等[27]开发了一种优化酶水解技术，分离得到4种组分，分别进行体外抗氧化研究，结果显示分子质量为0.84 kDa的寡糖组分有显著的抗氧化活性，并且羟自由基清除能力与维生素C清除能力相似。WAN J等[28]研究了藻酸盐寡糖对断奶仔猪的抗氧化活性，实验结果表明，藻酸盐寡糖可通过提高血清过氧化氢酶活性和谷胱甘肽含量来有效提高抗氧化防御特性。藻酸盐寡糖无毒无害又可作为抗氧化剂，未来在食品工业、医药、保健、化妆品等方面有一定的前景。

2.5 抗旱和促进生长作用

ZHANG Y等[29]采用河南省三个优质小麦品种（郑麦101，129和3596）作为实验材料，研究了在含有15%聚乙二醇（PEG）6000的水源条件下，藻酸盐寡糖对小麦幼苗生长和耐旱性的影响，用以提供新型植物抗旱剂在农业中应用的理论参考。结果表明，喷洒藻酸盐寡糖可以缓解由干旱引起的三个小麦品种的生长抑制程度，反映出幼苗长度、根长和生物量显着增加，丙二醛和脯氨酸含量显着降低，叶绿素含量（郑麦101除外）和部分抗氧化酶活性升高。UENO M等[30]研究发现藻酸盐寡糖能促进作为鱼类、贝类和一些甲壳类幼苗食物的两种藻类微绿球藻（Nannochloropsisoculata）和纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）的生长。研究还发现藻酸盐寡糖可以抑制有害鞭尾藻（Kareniamikimotoi）的生长。IWASAKIKI等[31]研究利用棒状杆菌（Corynebacteriumsp）分泌的裂解酶降解海藻酸钠，通过超滤膜进行纯化，将未降解的藻酸盐多糖完全去除，得到藻酸盐二聚糖与八聚糖混合物，以200～3 000 μg/mL的质量浓度范围内发现对莴苣根的伸长具有促进作用（约为对照组的2倍）。可以看出藻酸盐寡糖在农业方面具有很好的抗旱和促进生长作用，并且可以改善水中藻类的平衡，且藻酸盐寡糖本身无毒无害，因此可以作为一种新型肥料应用于农业方面，也可作为水质改善剂用于水中藻类的控制。

2.6 提高低密度脂蛋白的摄取

在脂蛋白代谢中起关键作用的肝低密度脂蛋白受体（low densitylipoprotein receptor，LDLR）通过降低血浆低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）浓度来降低心血管疾病的风险。YANG J H等[32]的研究发现藻酸盐寡糖以剂量和时间依赖的方式增加肝细胞LDLR的表达和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的细胞内摄取。藻酸盐寡糖可以增强SREBP-2核转录（调节元件结合蛋白-2，是LDLR基因表达必需的转录因子），进而促进LDLR表达，提高清除LDL-C的能力。此外，该研究还发现，藻酸盐寡糖可以下调前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/溶菌素9（protein convertase subtilisin/lysin 9，PCSK9）的表达，从而降低PCSK9介导的LDLR降解。可见，藻酸盐可在对LDL-C偏高所引起的冠心病、脑卒中和外周动脉病等疾病的预防中发挥重大作用。

2.7 其他活性

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一种高效的化学治疗剂，但其使用剂量受到其心脏毒性的限制。DOX诱导的心脏毒性能使氧化应激反应升高，并导致内质网介导的细胞凋亡。GUO J J等[33]研究表明通过藻酸盐寡糖预处理可以防止急性DOX心脏毒性，其机理主要是抑制DOX引起的氧化应激和内质网介导的细胞凋亡，因此藻酸盐寡糖是预防急性DOX心脏毒性有效的化合物。ZHANG Y等[34]研究了藻酸盐寡糖增效尿素对水稻产量和品质的影响，结果表明，藻酸盐寡糖增效尿素比普通尿素相比，每穗粒数增加，产量显著提高，精米率，整精米率和蛋白质含量均高于不施氮肥处理（对照）和普通尿素处理，其中较普通尿素处理分别增加1.82%、10.83%、7.59%。此外，稻米透明度、胶稠度、碱消值、最高黏度和崩解值也高于对照和普通尿素处理，垩白粒率和垩白度低于对照和普通尿素处理，且与对照相比差异均达显著水平。综上，藻酸盐寡糖增效尿素可促进水稻增产，对水稻品质也有一定的改善作用。海藻酸钠寡糖在去皮的南美白对虾的商业化保藏中也发挥这重要的作用，MA L K等[35]通过监测冻融损失、颜色、质地、肌原纤维蛋白含量、Ca2+-腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）活性、显微结构等分析，结果表明藻酸盐寡糖对脱皮虾（Litopenaeus vannamei）的解冻损失和质地变量（弹性和咀嚼性）有显著的抑制作用（P＜0.05），化学分析表明海藻酸钠寡糖处理有效地提高了冷冻虾肌原纤维蛋白含量和Ca2+-ATPase活性发挥了重要的作用。

3 前景与展望

藻酸盐寡糖是褐藻胶的寡聚物，可以通过酸降解法、物理降解法、酶降解法和氧化降解法等方法[36-37]制备，其中化学制备法有生产成本低，生产基础成熟等优点，但缺点也较为明显如产生三废、反应剧烈、易腐蚀设备等。物理讲解法具有操作简单、反应迅速、无污染等优点，缺点是设备成本高如微波辐射等，对操作人员的危害也较大。所以如今生物法制备藻酸盐寡糖成为主流，其具有无污染、反应温和、条件可控，特异性强等特点。

该综述对藻酸盐寡糖的的生物活性作用做了详细和更新的描述，介绍了藻酸盐寡糖对各种疾病及其对农业生产，食品和药物的有益应用发展。很显然，藻酸盐寡糖不仅可用于农业生产，在食品工业中，特别是在医疗应用中都具有广阔的前景，因此它将是未来极有价值的生物材料，并将为海洋资源添加新的和更高的价值给下一代可持续发展。此外，第四次工业革命正在创造一个新的机会根据下一代测序和多元组学的原理找出行动机制接近这样的代谢组学，蛋白质组学，转录组学等。虽然有几项研究体内实验证实了藻酸盐寡在不同途径中的生物学活性，藻酸盐寡应用于人类重大疾病临床治疗的相关研究大多数局限于中国。因此未来应进行更多的临床研究来评估藻酸盐寡在这个领域的影响。