醋酸菌对C57BL/6J小鼠的酒精性肝损伤的影响研究

2018-09-07清野慧至栗原仁松冈亮辅奥山洋平久能昌朗伊豆英惠程永强高彦祥韩北忠

中国酿造 2018年8期

清野慧至，栗原仁，松冈亮辅，奥山洋平，久能昌朗*，伊豆英惠，程永强，高彦祥，韩北忠

（1.丘比株式会社研究开发本部，东京调布 182-0002；2.独立行政法人酒类综合研究所品质与评价研究部门，广岛东广岛 739-0046；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

酒作为社会交流沟通的一种工具，在全球范围内发挥着作用并被广为饮用。少量饮酒可降低总死亡风险，但是过度饮酒则会损害身心健康[1]，尤其会增加负责乙醇代谢的主要脏器——肝脏的负担，因此长期大量饮酒会诱发肝脏疾病。关于其病症，在初期可见因脂肪蓄积[2]在肝脏或肝细胞损伤而导致谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GTP）流出至血液中[3]。症状进一步恶化则会发展成肝炎、肝硬化、肝癌[4]，症状越严重治疗越困难，因此早期的应对措施尤为重要。

肝脏具有多种乙醇代谢途径，其主要途径为介导于乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的途径[5]。当摄取了超过体内ADH及ALDH活性容许量的乙醇时，乙醇和乙醛就会滞留在体内，从而对机体产生各种影响[6]。其中乙醛的毒性较强，会通过氧化应激或形成脂质、蛋白质加合物对肝脏细胞造成伤害[7]。

醋酸菌是一种在食醋酿造过程中使用的革兰氏阴性需氧菌。醋酸菌产生醋酸是以乙醇为原料，通过酶的作用将其依次氧化为乙醛、醋酸的过程[8]。第一阶段的氧化反应在ADH的作用下发生，第二阶段的氧化反应在ALDH的作用下发生。

因此提出了同时摄取乙醇与醋酸菌可以减轻乙醇及乙醛毒性的假说。目前为止，已确认通过工业性的大量精制从醋酸菌中提取的具有ADH、ALDH活性的并与乙醇一同摄取，可降低呼气及血液中乙醇的浓度[9]。由此，有望通过同时摄取醋酸菌来减轻摄取乙醇对肝脏造成的损伤。在本研究中，对同时摄取乙醇和醋酸菌的小鼠的肝功能指标及肝脏脂质蓄积进行了评价，针对醋酸菌对于肝损伤的减轻作用进行了研究探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与试剂

醋酸菌[10]：对葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacterhansenii）的培养液进行离心，收集醋酸菌，使用干燥后的非活菌，其ADH及ALDH活性分别为0.56 U/mg、1.38 U/mg。

乙醇、福尔马林：购自日本和光纯药工业株式会社。酪蛋白、β-玉米淀粉、纤维素、混合矿物质、混合维生素：日本Oriental酵母工业株式会社；蔗糖：日本和田制糖株式会社；玉米油：日本J-OIL MILLS株式会社。

1.1.2 实验动物与饲料

25只C57/BL6J小鼠（8周龄、雄性、22～27 g、SPF）：购自日本SLC株式会社。将小鼠分别单独饲养于塑料笼具中，饲养环境为温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%、明暗周期12 h（明期为8AM-8PM）、SPF。饲料及水均为自由摄取。所有的动物实验均遵照日本国动物保护及管理相关法律（1973年法律第105号）及实验动物的饲养及保管和减轻痛苦的相关准则（2013年环境省告示第84号），经Kewpie株式会社研究开发本部动物实验委员会的审查及批准后实施（批准编号：17-03）。

根据AIN-76组成[11]，按照酪蛋白20%、β-玉米淀粉15%、纤维素5%、混合矿物质3.5%、混合维生素1%、蔗糖45.5%、玉米油10%的比例调配试验饲料。

1.2 仪器与设备

转氨酶C-Ⅱ测定仪（431-30901）、甘油三酯E-测定仪（432-40201）、磷脂-C测定仪（433-36201）、胆固醇E-测定仪（439-17501）：和光纯药工业株式会社。

1.3 方法

1.3.1 实验组设置

根据现有报道[12]变更了乙醇的给予。让小鼠自由摄食试验饲料7 d，实施预饲养后将其分为对照组、乙醇组、乙醇+醋酸菌组3组。

对照组：为了使对照组小鼠摄入的乙醇和卡路里与其他组小鼠相同，给予了每只小鼠0.25mL的44mg/100mL蔗糖[13]。

乙醇组：用灌胃针及1 mL注射器经口给予小鼠25 mg/100 mL的乙醇，按照0.25 mL（以乙醇量计2.5 g/kg）每天给予3次（9 AM、12 PM、3 PM）。

（乙醇+醋酸菌）组：将醋酸菌10mg混悬于25mg/100mL的乙醇0.25 mL中，给予乙醇+醋酸菌组，同样每天给予3次（9 AM、12 PM、3 PM）。

在经口给予开始前1h至经口给予结束期间（8AM-3PM）没有喂食饲料。经口给予开始14 d后，在最后经口给予3 h后，在异氟烷麻醉下进行了腹部后大静脉采血采样。

1.3.2 生化学分析

由采集到的血液分离得到血清，供进行各种指标的测定。

AST、ALT通过转氨酶C-Ⅱ测定仪进行了测定。甘油三酯（triglyceride，TG）、磷脂（phospholipid，PL）、总胆固醇（total cholesterol，T-chol）分别采用甘油三酯E-测定仪、磷脂-C测定仪、胆固醇E-测定仪进行了测定。肝脏的脂质分析采用Folch法提取脂质后再以化学法[14]进行了测定。

1.3.3 组织学分析

将小鼠肝脏以10%福尔马林进行固定后，制作了冷冻组织块。切片的制作委托给日本Techno-Science株式会社。制作成6μm厚度的冷冻切片，进行苏木精-伊红染色及油红O染色以供进行组织学分析[13]。

1.3.4 统计学分析

使用IBM SPSS Statistics 20统计分析软件进行统计学分析。由于对照组出现了2.44 g/100 g体质量的低于单位体质量肝脏质量平均值（3.50 g/100 g）体质量30%以上的个体，所以将该动物个体从统计分析的对象中排除。此外，在乙醇组和乙醇+醋酸菌组，相对于其各组体质量变化率的平均值-6.05%、-6.90%，乙醇组出现了体质量变化率-10.9%，乙醇+醋酸菌组出现了体质量变化率-10.7%和-12.4%的个体，因此也将其从统计分析的对象中排除。最终进行了统计分析的个体数为对照组：n=8、乙醇组：n=7，乙醇+醋酸菌组：n=6。通过Tukey检验对其显著性差异进行比较，（P＜0.05）表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 对小鼠生长发育参数及肝脏质量的影响

小鼠生长发育参数及肝脏质量的测定结果如表1所示。

表1 小鼠生长发育参数及肝脏质量Table 1 Growth parameters and liver mass of mices

由表1可知，乙醇组与（乙醇+醋酸菌）组的最终体质量、体质量增加量、摄食量均显著低于对照组的数值（P＜0.05），但是乙醇组与（乙醇+醋酸菌）组之间并未见显著性差异（P＞0.05）。乙醇组的肝脏质量显著高于对照组和（乙醇+醋酸菌）组（P＜0.05）。

2.2 对小鼠血液生化学指标的影响

小鼠血清的生化学检查结果如表2所示。

组别对照组乙醇组（乙醇+醋酸菌）组AST/（IU·L-1）ALT/（IU·L-1）TG/（mg·100 mL-1）PL/（mg·100 mL-1）T-chol/（mg·100 mL-1）15.5±0.5c 4.0±0.2b 46.7±5.8 192.4±7.6 89.5±4.5 48.0±4.9a 15.8±2.6a 72.9±13.6 192.8±8.7 88.0±4.7 28.8±2.6b 8.1±0.8b 57.9±4.8 183.5±6.6 81.1±2.9

由表2可知，乙醇组的肝功能指标AST及ALT显著高于对照组（P＜0.05）。此外，（乙醇+醋酸菌）组的AST、ALT则显著低于乙醇组（P＜0.05）。而甘油三酯、磷脂、总胆固醇这三组间未见显著性差异（P＞0.05）。

2.3 对小鼠肝脏脂质蓄积的影响

小鼠肝脏的脂质影响分析结果如图1所示，小鼠肝脏组织学分析结果如图2所示。

由图1可知，对照组的甘油三酯量和胆固醇量分别为（12.6±1.0）mg/g、（4.82±0.10）mg/g肝脏，与之相比，乙醇组分别为（77.3±11.0）mg/g、（6.30±0.20）mg/g肝脏，显著高于对照组（P＜0.05）。乙醇+醋酸菌组的甘油三酯量和胆固醇量分别为（38.6±5.9）mg/g、（5.26±0.24）mg/g肝脏，显著低于乙醇组（P＜0.05）。关于磷脂量，3组间未见显著性差异（P＞0.05）。

图1 乙醇和醋酸菌对于脂质在小鼠肝脏中蓄积的影响Fig.1 Effect of acetic acid bacteria extract and ethanol on lipid accumulation in liver of mices

图2 小鼠肝脏脂质积累的组织学分析Fig.2 Histological analysis of lipid accumulation in liver of mices

由图2可知，通过组织学分析，可见乙醇组的肝脏中存在中性脂质的蓄积。（乙醇+醋酸菌）组与乙醇组相比较，中性脂质的蓄积较轻微。

3 讨论

摄入乙醇导致肝损伤的症状，因摄入的乙醇量及时间不同而有所不同。酒精性肝损伤模型关于乙醇的使用量、时间长短、方法，有各种各样的报道。急性模型中会一次性给予较大量的乙醇（约5 g/kg）[15]。慢性模型中会在持续较长的一段时间（4～6周）给予较少量含有乙醇（1%vol～5%vol）的饲料[16]。在本研究中，连续14d，每天3次，间隔3 h经口给予乙醇2.5 g/kg。这样的给予安排可以认为是介于上述急性模型和慢性模型中间的位置。

据报道，过量摄入乙醇会诱导肝功能指标AST、ALT的升高以及甘油三酯和胆固醇在肝脏中的蓄积[2-3]。在此次的试验中，通过在给予乙醇的同时给予醋酸菌，抑制了乙醇导致的AST、ALT的升高和甘油三酯、胆固醇在肝脏中的蓄积。在现有报道中，人在摄入乙醇时，同时摄入醋酸菌与不摄入醋酸菌相比较，发现呼气及血液中的乙醇浓度有所降低[9]。关于醋酸菌的作用机制，推测可能是由于醋酸菌中所含的ADH和ALDH使乙醇分解。但本试验的结果表明，通过醋酸菌的服用酒精性肝损伤的改善程度为AST减少40%、ALT减少49%、TG减少50%。比过去试验中显示的抑制血液中的乙醇浓度的上升作用更高（24%）。研究表明醋酸菌可以防止发酵食品kombucha tea的氧化，对肝功能有保护作用[17]。本试验中使用的醋酸菌也可能对肝脏具有保护作用。本研究尚未明确对肝脏的影响，为今后的研究课题。

此次试验中，无论乙醇与醋酸菌灌胃与否，血清的脂质参数（甘油三酯、磷脂、总胆固醇）没有显著差异（P＞0.05）。过去的报告中，灌胃乙醇会导致血清的甘油三酯，总胆固醇浓度的上升[11，17]。认为此差异是一次灌胃的乙醇量不同造成的。本试验中灌胃2.5 g/kg的乙醇。而前述的报告灌胃了5g/kg的乙醇。

乙醇组和（乙醇+醋酸菌）组小鼠的摄食量和体质量增加量，与不给予乙醇的对照组相比较，呈现显著低值。在过去的研究文献中，有报道称摄入乙醇会减少食物摄入量和降低了体质量增加[17]。然而，由于本次试验中乙醇组和（乙醇+醋酸菌）组之间没有显着差异，认为在此次试验系统中适宜地评价了乙酸菌对乙醇给药的影响。

在过去的研究中，报道了几种减轻酒精性肝损伤的天然成分。如类黄酮的一种木犀草素，可以减少由于摄入乙醇造成的肝脏中脂肪的蓄积[17]。此外，S-腺苷甲硫氨酸表现出对摄入乙醇时产生的活性氧的抗氧化作用[19]。所有这些均是直接影响肝脏从而抑制肝损伤的。此外，醋酸菌具有减低呼吸以及血液中的乙醇浓度的作用[9]与其他素材相比具有特殊性。通过醋酸菌与直接影响肝脏的天然成分配合使用，有望能够得到叠加或协同效果。