基于DNA与单层二硫化钨的相互作用荧光法检测汞(Ⅱ)离子

关雅南，张 浩，李晓双，连丽丽，王希越，高文秀，祝 波，娄大伟

(吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

汞是一种高毒性的重金属离子，在江河湖泊、工厂污水等环境中广泛存在.汞及其化合物是剧毒性的环境污染物[1]，可对人类的身体健康构成不同程度的危害.因此，研究我们人类的饮用水中Hg2+离子的定性分析具有重要意义[2,3].目前，检测Hg2+离子的方法有很多，包括原子吸收光谱法[4]、电化学分析法[5,6]、比色法[7]、荧光法[8,9]等，其中，荧光法由于具有操作简单，分析检测时间短，成本低，选择性好等众多优点，受到了人们的广泛关注.因此，我们选择使用荧光法对Hg2+离子进行检测.近年来，随着石墨烯的强大发展与应用，二维类石墨烯物质也引起了人们的研究兴趣.目前，二维类石墨烯物质(包括过渡金属二硫化物，氧化物等)由于具有其独特的二维层状结构，在检测方面有很多应用.并且国内外研究者在检测应用方面也做出了很多报道.如Hao,Liling等人[10]报道了一种改进的基于RCA的CRET适体传感器，用于通过化学发光供体Co2+/ABEI-AuNFs和化学发光受体层状WS2纳米片之间的CRET过程来检测金黄色葡萄球菌.WS2是典型的层状结构材料，具有片层的堆叠，在层与层之间有较弱的范德华力，能够通过物理或化学方法得到少层或单层的片状结构[11].在本文中，我们提出了一种DNA与WS2相互作用检测Hg2+离子的新方法.通过研究WS2的浓度对实验反应的影响，确定最佳实验条件，从而对一系列的Hg2+离子浓度进行检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DNA寡核苷酸是从上海生工生物工程技术有限公司购买的.DNA寡核苷酸序列为：3′-FAM-TTTCTTCTTGGGTTGTTGTTT-5′.

NaCl，MgCl2和Hg(NO3)2购自国药集团化学试剂有限公司，十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)均购自中国天津市永大化学试剂有限公司.自制40 mmol·L-1pH 7.4的PBS缓冲液(将7.16 g Na2HPO4·12H2O和3.12 g NaH2PO4·2H2O在1 L超纯水中溶解)，在整个实验中使用.

荧光测量使用的是岛津RF-5301PC光谱荧光光度计.在520 nm激发波长处得到荧光光谱.pH值测量使用的是中国北京赛多利斯仪器有限公司生产的Sartorius PB-10 pH计.超纯水是使用Milli-Q试剂水系统(Millipore，Bedford，MA，USA)纯化的.

1.2 实验过程

将25 μmol·L-13 μL ssDNA、40 mmol·L-1150 μL PBS缓冲溶液、3 mol·L-110 μL NaCl和3 mol·L-110 μL MgCl2混合在一起，然后，将不同浓度的10 μL WS2加入到上述混合溶液中，在25 ℃下振荡反应30 min.最后，将一系列不同浓度的10 μL Hg2+离子加入到该混合溶液体系中，在25 ℃下振荡反应30 min，混合溶液的总体积为300 μL.所有实验均重复三次.

2 结果与讨论

2.1 该方法检测Hg2+离子可行性分析

为了验证该方法的可行性，我们分别对以下三种情况进行了测定：(a)不加WS2和待测物Hg2+离子；(b)加WS2，不加待测物Hg2+离子；(c)加WS2和待测物Hg2+离子.如图1所示，发现不加WS2和待测物Hg2+离子的a曲线的荧光强度最高；加WS2，不加待测物Hg2+离子的b曲线的荧光强度最低；加WS2和待测物Hg2+离子的c曲线的荧光强度与b曲线相比又增强.

Wavelength/nm图1 不同条件下测得的荧光光谱图

这是由于DNA与WS2相互作用，当不存在待测物Hg2+离子时，被标记在ssDNA上的羧基荧光素(FAM)基团吸附在WS2上，由于发生荧光能量共振转移，导致荧光淬灭；当待测物Hg2+离子存在时，ssDNA中的胸腺嘧啶(T)与Hg2+离子形成T-Hg2+-T错配结构，其余部分根据碱基配对原则，杂交形成刚性的双链DNA(dsDNA)，标记的FAM荧光基团不会吸附在WS2上，因此，体系的荧光强度增强.实验结果证明此方法检测Hg2+离子可行.

2.2 WS2的浓度对反应的影响

由于WS2在整个实验中起到了很重要的作用，并且WS2的浓度对实验反应也有一定的影响，因此，对WS2的一系列浓度进行了实验.如图2所示，其中，从a到f的WS2浓度分别为0 mg/ml；0.003 mg/ml；0.01 mg/ml；0.017 mg/ml；0.023 mg/ml；0.03 mg/ml.从图中可以看出，随着WS2的浓度增大，实验体系的荧光强度逐渐下降.为了满足实验的检测条件，将浓度为0.017 mg/ml的WS2，选择用于进行下面的实验.

Wavelength/nm图2 WS2的浓度对反应的影响图

2.3 Hg2+离子检测

基于确定了WS2的最佳浓度，因此，对一系列的Hg2+离子浓度进行了检测.如图3所示，其中，从a到e的Hg2+离子浓度分别为0 nmol·L-1；80 nmol·L-1；320 nmol·L-1；800 nmol·L-1；1 600 nmol·L-1.从图中可以明显看出，随着加入的Hg2+离子浓度越大，实验体系的荧光强度也随之增强.

Wavelength/nm图3 不同浓度的Hg2+离子检测图

2.4 Hg2+离子检测方法的选择性

为了证明检测Hg2+离子方法的选择性，把800 nmol·L-1的Hg2+离子替换成1 mol·L-1的其它金属离子(如Al3+，Zn2+，Mg2+，Fe3+，Fe2+，Ca2+，Mn2+，K+，Co2+)，对其做了几组对照实验.实验过程与检测Hg2+离子的过程相同，如图4所示，在实验条件相同的情况下，只有Hg2+离子对体系的荧光强度有明显的影响.结果表明该实验对于Hg2+离子的检测具有良好的选择性.

图4 Hg2+离子检测方法的选择性图

2.5 Hg2+离子检测方法的抗干扰性

为验证该方法对Hg2+离子的特异性识别能力，考察了其它可能产生干扰的一系列金属离子的影响.如Al3+，Zn2+，Mg2+，Fe3+，Fe2+，Ca2+，Mn2+，K+，Co2+.将800 nmol·L-1的Hg2+离子和1 mol·L-1的其它金属离子加入到实验中，结果如图5所示，当Hg2+离子存在时，加入其它不同金属离子后，体系的荧光强度并无明显变化，这表明其它金属离子不会干扰对Hg2+离子的检测.

图5 Hg2+离子检测方法的抗干扰性图

3 结 论

总之，我们基于Hg2+离子特异性地与T碱基结合，进而ssDNA上剩余的碱基部分互相杂交形成刚性的dsDNA，被标记的FAM基团由于不会吸附在WS2上导致其荧光增强的原理，建立了一种检测Hg2+离子的荧光方法.实验结果表明该方法具有操作简单、成本低等优点.同时，检测体系对Hg2+离子表现出良好的选择性，而且常见的一些阳离子也不会干扰其测定.