解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液和化学杀菌剂混配抑制葡萄白腐病菌的室内筛选

段海明，余 利，梁海申，黄伟东，余海兵

(安徽科技学院 农学院,安徽凤阳 233100)

葡萄白腐病是葡萄生产上的四大重要病害之一，一般年份造成葡萄产量损失达10%～50%，严重年份高达80%以上，甚至绝收。葡萄白腐病主要危害果穗、其次是新梢和叶片等[1]。该病害由白腐垫壳孢(Conielladiplodiella)引起，病原菌随病残体落入土壤中越冬，成为第2年的初侵染来源，病菌在套袋之前侵入果实，常造成大量落果腐烂，造成重大损失[2]。

目前，葡萄白腐病防治的报道以化学防治和生物防治为主。传统的化学杀菌剂由于使用方便、价格低廉等因素在国内推广面积大，使用者容易接受，然而大多数杀菌剂却面临抗药性增强、农药残留加剧，甚至造成农业面源污染等问题，化学药剂要减量使用在全社会已形成广泛共识，但杀菌剂减量用药的前提是防治效果不下降，所以寻找经济有效的化学杀菌剂减量增效方法已成为中国当今植物病害防控的重大战略需求[3-4]。绿色防治技术正日益兴起，利用自然界中分布最广泛的微生物开发环保、无公害的生防制剂来进行有效的生物防治，从而逐步降低化学农药的使用量，使葡萄品质提升，符合当前农药减量使用和绿色防控的要求[5-6]。对葡萄白腐病具有拮抗作用的有真菌、放线菌和细菌等生防菌，拮抗菌对葡萄白腐病菌以室内抑制效应研究为主，田间推广使用的还未见报道，主要是由于筛选到的生防菌的抑制活性尚未达到大规模推广应用要求。因此，还需要持续筛选出对葡萄白腐病菌具有更高抑制作用的拮抗菌供生产上使用[7-9]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)gfj-4分离自罹病番茄果实，于2014年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC NO:M 2014444)，已获授权国家发明专利[10]。经前期对峙培养法证明该菌株对葡萄白腐病菌具有较强的抑制活性，但生防菌直接使用受外界环境的影响较大，发酵代谢产物的开发利用更接近生产实际。因此，本研究测定种子液培养时间、不同发酵时间对解淀粉芽孢杆菌gfj-4产发酵上清液抑菌活性的影响，以及发酵上清液、脂肽类粗提物对葡萄白腐病菌的抑制活性。在此基础上，为扩大该生防菌代谢产物的利用价值，测定生防菌产发酵上清液和7种化学杀菌剂混配组合对葡萄白腐病菌的抑制效应，以期为化学杀菌剂的减量化使用和葡萄白腐病的防控提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试杀菌剂 95%苯醚甲环唑原药、96%腈菌唑原药和96%戊唑醇原药由山东亿嘉农化有限公司、山东联合农药工业有限化司和山东华阳农药化工有限公司提供；50%福美双可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂、70%丙森锌可湿性粉剂分别由南通宝叶化工有限公司、山东大成农药股份有限公司、拜耳作物科学有限公司和上海禾本药业有限公司提供。杀菌剂原药采用丙酮溶解，配制成1.0×104μg/mL 的母液置4 ℃冰箱保存，备用；制剂用灭菌水溶解，现配现用。

1.1.2 供试菌株 葡萄白腐病菌(C.diplodiella)分离纯化自安徽省凤阳县郊区葡萄白腐病典型发病果穗，并进行分离纯培养和鉴定。

1.1.3 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖18.0 g，琼脂15.0 g，去离子水1 L。

NA培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，琼脂15.0 g，pH 7.0 (可不加琼脂制成NB培养基)。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌gfj-4不同菌龄对菌株产发酵上清液抑制葡萄白腐病菌的活性测定 解淀粉芽孢杆菌gfj-4在NA培养基上划线培养48 h，挑取单菌落菌苔转接入NB液体培养基中，33 ℃、120 r/min 摇培12 h，然后以φ=10% 的接种量接种到NB培养基中，于33 ℃、120 r/min分别培养4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和14 h，培养结束在11 180 g、4 ℃下离心10 min得菌体，用灭菌水调节菌悬液OD600=1.0作为种子液，以φ=0.5%的接种量接种到100 mL NB培养基中，然后置于33 ℃、120 r/min的恒温摇床中培养72 h，然后在11 180 g、4 ℃ 下离心20 min获取发酵上清液，经0.22 μm滤膜过滤后保存于4 ℃冰箱，备用。采用菌丝生长速率法测定发酵上清液20倍稀释液对葡萄白腐病菌的抑制率，接种结束后置于27 ℃恒温恒湿培养箱中培养72 h，每质量浓度处理3皿，重复3次，采用十字交叉法测量菌落直径，求出不同菌龄菌株产生的发酵上清液对病菌的抑制率[11]。

1.2.2 不同培养时间对菌株gfj-4发酵上清液抑制葡萄白腐病菌的活性测定 获取种子液后以φ=0.5% 的接种量接入到装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，分别摇培24 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h，然后在11 180 g、4 ℃ 下离心20 min，获取发酵上清液后经0.22 μm滤膜过滤后保存于4 ℃冰箱，备用。按照“1.2.1”的方法求出不同培养时间制得的发酵上清液20倍稀释液对葡萄白腐病菌的抑制率。

1.2.3 不同稀释倍数的发酵上清液对葡萄白腐病菌的抑制活性测定 将发酵培养时间为72 h制得的发酵上清液按一定比例与冷却到50 ℃左右的PDA培养基充分混匀，使得发酵上清液在PDA培养基中的体积分数分别为6.7、8.3、12.5、16.7和33.3 μL/mL，按照“1.2.1”的方法测定不同稀释倍数的发酵上清液对葡萄白腐病菌的抑制活性，利用SPSS 13.0软件计算发酵上清液对葡萄白腐病菌的EC50。

1.2.4 脂肽粗提物的制备及抑制活性测定 将培养72 h制得的发酵上清液用7 mol/L盐酸调至pH=2，然后分装到离心管中，每管8 mL，过夜沉淀后在11 180 g、4 ℃下离心20 min，去上清液，向每管沉淀中加入0.5 mL甲醇萃取8 h，然后在11 180 g、4 ℃下离心20 min，取上清液。采取同样的方法再萃取2次，合并3次上清液保存于4 ℃冰箱，备用[12]。制得的脂肽粗提物按一定比例与冷却到50 ℃左右的PDA培养基充分混匀，使得脂肽粗提物的体积分数分别为1.0、2.0、4.0、8.0和 16.0 μL/mL，按照“1.2.1”的方法测定脂肽粗提物对葡萄白腐病菌的抑制活性，计算脂肽粗提液对葡萄白腐病菌的EC50。

1.2.5 7种化学杀菌剂对葡萄白腐病菌的室内毒力测定 测定苯醚甲环唑、腈菌唑、戊唑醇、福美双、百菌清、丙森锌和代森锰锌7种化学杀菌剂对葡萄白腐病菌的抑制活性(表1)。接种完毕后置于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养72 h，用十字交叉法测量菌落直径。采用SPSS 13.0软件求出7种化学杀菌剂对病菌的毒力回归方程、EC50值、95%置信区间和R2。

表1 7种化学杀菌剂质量浓度设置Table 1 Mass concentration gradient of 7 fungicides

1.2.6 杀菌剂新型混剂的毒性比测定 采用陈福良等[13]的方法设计菌株gfj-4发酵上清液和化学杀菌剂的混配试验，以发酵上清液和不同化学杀菌剂对葡萄白腐病菌的EC50为基础，按其EC50值剂量的比例分别设置0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，7∶3、8∶2、9∶1、10∶0共11个配比(体积比)，以不加药剂处理为对照，采用菌丝生长速率法测定各配比的抑菌率和毒性比。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间的种子液对解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液抑菌活性的影响

由图1可见，随着菌株gfj-4种子液培养时间的增加，生防菌所产发酵上清液对葡萄白腐病的抑制率逐渐降低。培养时间为4 h制得的发酵上清液对病菌的抑制率最大，为92.9%(P<0.05)。随着培养时间的进一步增加，菌株所产发酵上清液对病菌的抑制率逐步下降，当培养时间为14 h时抑制率下降至75.7%。

图1 不同培养时间的种子液对菌株gfj-4发酵上清液抑菌活性的影响Fig.1 Effects of seed broth at different =culture time on antifungal activity of strain gfj-4 fermentation supernatant

2.2 不同培养时间对菌株gfj-4产发酵上清液抑制葡萄白腐病菌的影响

由图2可见，随着菌株gfj-4发酵培养时间的增加，发酵代谢活性物质对葡萄白腐病菌的抑制率先升高后降低。培养时间为84 h制得的发酵上清液的20倍稀释液对病菌的抑制率最大为96.1%(P<0.05)。随着培养时间的进一步延长，所产发酵上清液对病菌的抑制率下降，培养时间为96 h时抑制率下降至88.5%。

图2 不同培养时间对菌株gfj-4发酵上清液抑菌活性的影响Fig.2 Effects of different culture time on antifungal activity of strain gfj-4 fermentation supernatant

2.3 不同稀释倍数的发酵上清液对葡萄白腐病菌的抑制活性

由表2可知，解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液的体积分数从6.7 μL/mL增至33.3 μL/mL，其对葡萄白腐病菌的抑制率从16.7%增至90.0%。经SPSS 13.0软件分析得出发酵上清液对葡萄白腐病菌的EC50为11.10 μL/mL(R2=0.95)。经解淀粉芽孢杆菌发酵上清液处理的葡萄白腐病菌菌丝扩展缓慢，生长稀疏(图3)。

表2 不同稀释倍数的发酵上清液对葡萄白腐病菌的抑制率Table 2 Inhibition rate of different dilution ratios of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant to C.diplodiella

2.4 不同稀释倍数的脂肽粗提物对葡萄白腐病菌的抑制活性

由表3可知，脂肽粗提物的体积分数从1.0 μL/mL 增至16.0 μL/mL，其对葡萄白腐病菌的抑制率从6.3%增至98.0%，经SPSS13.0软件分析得出脂肽粗提物对葡萄白腐病菌的EC50为3.02 μL/mL (R2=0.96)。与对照相比可以发现，经解淀粉芽孢杆菌脂肽粗提物处理的葡萄白腐病菌丝扩展缓慢，高浓度发酵脂肽粗提物处理可使菌丝颜色转变为黄褐色，边缘生长不规则，高浓度发酵上清液对病菌的抑制效果较好(图4)。

A.对照 Control；B、C、D、E、F.分别为菌株gfj-4发酵上清液稀释30、60、80、120和150倍 B, C, D, E, F are fermentation supernatant of strain gfj-4 diluted 30, 60, 80, 120 and 150 times, respectively

2.5 7种化学杀菌剂对葡萄白腐病菌的抑制活性

由表4可知，葡萄白腐病菌对麦角甾醇生物合成抑制剂苯醚甲环唑、腈菌唑和戊唑醇的敏感性较高。其中，苯醚甲环唑对葡萄白腐病菌的抑制活性最高，EC50为0.02 μg/mL；其次为腈菌唑和戊唑醇，它们对病菌的EC50分别为0.03 μg/mL和0.04 μg/mL。保护性杀菌剂福美双和百菌清对病菌的EC50分别为2.81 μg/mL 和3.51 μg/mL，而丙森锌和代森锰锌对病菌的室内抑制活性较差，EC50分别为23.72和33.43 μg/mL。

2.6 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与化学杀菌剂复配组合的毒性比

由表5～7可见，解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液与苯醚甲环唑和腈菌唑复配对葡萄白腐病菌的抑制活性表现为增效作用，其中与苯醚甲环唑以3∶7的体积比混配毒性比最高，达1.60；发酵上清液与腈菌唑以2∶8的体积比混配毒性比最高，为1.49。发酵上清液和戊唑醇混配既有增效作用也有拮抗作用，以3∶7的体积比混配毒性比最高，为1.30。

A.对照 Control；B、C、D、E、F.分别为菌株gfj-4脂肽粗提物稀释62.5、125、250、500和1 000倍 B, C, D, E, F were lipopeptide crude extract of strain gfj-4 diluted 62.5,125,250,500 and 1 000 times, respectively

表3 不同稀释倍数的脂肽粗提物对葡萄白腐病菌的抑制率Table 3 Inhibition rate of different dilution ratios of lipopeptide crude extract to C.diplodiella

由表8 ～ 11可见，解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液和4种保护性杀菌剂复配对葡萄白腐病菌的抑制活性表现各异。发酵上清液与福美双混配仅以5∶5体积比表现为相加作用，其余表现为拮抗作用；发酵上清液与百菌清混配主要表现为相加作用；发酵上清液与丙森锌混配主要表现为拮抗作用；发酵上清液与代森锰锌不同的配比分别表现为相加和增效作用，其中以1∶9体积比混配毒性比最高，达1.25。

表4 7种化学杀菌剂对葡萄白腐病菌的毒力测定Table 4 Toxicity levels of 7 chemical fungicides to C.diplodiella

表5 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与苯醚甲环唑复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 5 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and difenoconazole to C.diplodiella

表6 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与腈菌唑复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 6 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and myclobutanil to C.diplodiella

表7 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与戊唑醇复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 7 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and tebuconazole to C.diplodiella

表8 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与福美双复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 8 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and thiram to C.diplodiella

表9 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与百菌清复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 9 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and chlorothalonil to C.diplodiella

表10 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与丙森锌复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 10 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and propineb to C.diplodiella

表11 解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与代森锰锌复配对葡萄白腐病菌的毒性比Table 11 Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and mancozeb to C.diplodiella

3 讨 论

中国葡萄的主栽品种对白腐病普遍缺乏抗性，而且病菌分生孢子器产生的快而多，分生孢子器能够和病残体在土壤中腐生，抗逆力极强，所以开展其高效生物防治技术研究尤为迫切[14]。生防菌产发酵液活性物质和活体菌剂相比对外界环境条件的耐受性高，开展其对葡萄白腐病菌的抑制活性研究具有更大的实践意义[15]。郭正彦等[16]分离一株放线菌A2C产发酵液的10倍稀释液对葡萄白腐病菌的抑制率达100%；尹向田等[17]从土壤中分离到一株对葡萄白腐病菌有强烈抑制作用的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，其无菌发酵液稀释20倍对菌丝的抑制率为96.8%。郝双红等[18]报道一株侧柏内生菌异茎点霉属(Paraphoma)真菌G21发酵液的10倍稀释液对葡萄白腐病菌的抑制率大于90%，EC50为73.5 μL/mL；葛平华等[19]以菌丝生长速率法测定解淀粉芽孢杆菌GM-1菌株发酵液的26倍稀释液对葡萄白腐病菌的抑制率达87.13%；于晓丽等[20]从西洋参根部分离获得解淀粉芽孢杆菌YTB1407对葡萄白腐病菌具有较好的拮抗效果，采用对峙培养法获得抑菌带为8.75 mm。本研究所涉及的解淀粉芽孢杆菌的发酵上清液对葡萄白腐病菌的抑制效果较好，发酵上清液30倍稀释液对葡萄白腐病菌的抑制率达90%，具有较大的潜在开发利用价值。生防菌一般田间应用效果要差于化学杀菌剂，使用规模较小，葡萄白腐病的防治还以化学药剂防治为主，关键在不降低药效的基础上，如何降低化学杀菌剂的使用量，从而降低农药残留和对环境的污染[20-21]。从本研究可以看出，解淀粉芽孢杆菌发酵上清液与苯醚甲环唑、腈菌唑、戊唑醇、代森锰锌等药剂部分配比在室内表现较强的增效作用，在协同防治葡萄白腐病以及化学杀菌剂减量增效方面具有较高的潜在利用价值。从本研究还可以看出，从发酵上清液中提取的脂肽类物质对葡萄白腐病菌具有较强的抑制效果，超过发酵液对病菌的抑制水平，但其田间防治效果还有待于进一步得以验证。本研究可为葡萄白腐病的防治措施更新和研制新的生物农药和化学杀菌剂的复配剂提供技术依据。