三七茎叶总皂苷对心肌缺血再灌注损伤保护作用研究＊

丁 岩，游丽萍，蒋嘉明，时 桢，杨 昕，何泽慧

（上海中医药大学教学实验中心 上海 201203）

心血管疾病是严重威胁人类健康的疾病之一，据世界卫生组织统计结果显示，全球每年死于心血管病的人约占总死亡人数的近1/6[1]。心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI），是指由于某些原因导致心脏组织或细胞缺血或缺氧一段时间，后恢复血流供应的现象，此时细胞或组织不但没有恢复正常生理功能，反而产生一系列更为严重的损伤[2]。MIRI可造成心脏舒缩功能抑制、细胞膜受损、心肌组织坏死等，其机制涉及自由基损伤、细胞凋亡、炎症反应等因素[3-4]。现代研究表明，中药可以通过降低心肌耗氧量、清除自由基、抗心肌细胞凋亡、促血管新生、调节心肌组织中基因的表达等机制起到抗心肌缺血再灌注损伤的作用[5-8]。三七为五加科人参属植物，是常用的活血化瘀中药，近年来随着市场需求的增加，综合利用三七各部位，充分开发利用三七具有重要意义。三七茎叶是三七的活性部位，有研究表明其主要活性成分三七茎叶总皂苷（Panax notoginsengsaponins in stems and leaves，PNSSL）对于心血管系统具有与根皂苷相似的生物活性[9]，并具有一定的抗心律失常和抗心绞痛的作用[10-11]，但三七茎叶总皂苷对于在体大鼠缺血再灌注模型的影响尚未见报道[12-13]，且药物作用的机制研究尚不明确。

本实验建立在缺血再灌注大鼠心肌损伤模型基础上，给予三七茎叶总皂苷进行药物干预，通过检测心电图ST段变化，心肌梗死面积，血清中心肌酶LDH、CK、AST、ALT活性，心肌组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量，并通过病理切片观察组织损伤，综合评价药物对于缺血再灌心肌损伤的保护作用，为三七茎叶总皂苷的开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体重200-250 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。动物饲养在室温（22±2）℃，湿度（45%-65%）和明暗交替（12 h∶12 h）环境中，自由摄食和饮水。实验操作均严格按照实验动物伦理学相关规则进行。

1.2 药品与试剂

三七茎叶总皂苷来源于云南文山齐丹制药有限公司，纯度80%；地奥心血康胶囊，成都地奥制药集团有限公司（批号国药准字Z1091005）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号20170303）、肌酸激酶（CK）测定试剂盒（批号20170302）、谷草转氨酶（AST）测试盒（批号20180120）、谷丙转氨酶（ALT）测试盒（批号20180120）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（批号20171118）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号20171118）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定试剂盒（批号20171118），由南京建成生物科技有限公司提供。

1.3 实验仪器

HX-300S型动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；722N型分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；TGL-20000cR型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；RM6240 BD型多通道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）。

2 方法

2.1 动物分组及给药

SD雄性大鼠随机分为6组，即假手术组、模型组、三七茎叶总皂苷组（40，80，160 mg·kg-1）、地奥心血康组（60 mg·kg-1），以10 mL·kg-1剂量灌胃预防给药，每天同一时间灌胃一次，共给药七天，第七天给药后半个小时进行心肌缺血再灌注模型建立。假手术组、模型组给予等量的生理盐水。

2.2 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立

用1%的戊巴比妥钠50 mg·kg-1进行腹腔注射麻醉大鼠，背部固定，大鼠的四肢皮下连接有心电图电极，用以记录标准Ⅱ导联心电图。经口部插气管，连接小动物呼吸机，设置呼吸频率为60次/min，潮气量10 mL。于左侧第四肋间开胸，用6/0丝线在肺动脉圆锥和左心耳交界下缘1-2 mm处（左冠状动脉前降支LAD）进行结扎，以结扎部分紫绀和心电图ST段抬升作为结扎成功的标志[14-16]。所有动物经结扎冠脉60 min后松扎，再灌注45 min。

2.3 大鼠心肌缺血再灌注损伤心电图ST段的变化

大鼠麻醉后仰位固定，四肢皮下连接心电图电极，记录结扎前、缺血后及再灌注后各组Ⅱ导联心电图心电图，观察ST段的抬高情况。

2.4 心肌梗死面积

造模后，腹主动脉取血，并迅速取出心脏，置冰冷生理盐水中冲洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌组织，置于-20℃冰箱放置10 min。从心尖开始，垂直于冠状面将心脏切成2 mm厚的薄片5片，将切好的心脏移动到1%TTC磷酸盐缓冲染液的玻璃瓶中。37℃恒温水浴避光孵育15 min，不断振荡使其充分着色。取出后置10%甲醛溶液中固定。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗死区为白色，高分辨相机拍照后，用Image-Pro-Plus 5.1软件分析并计算梗死面积，分析梗死区及整体心肌面积，以梗死区心肌面积占整体心肌面积的百分比（%）作为衡量梗死范围的指标。

梗死范围%=梗死区心肌面积 整体心肌面积×100%

2.5 血清中心肌酶活性测定

模型建立成功后，腹主动脉取血，将血液静置约2 h，4℃低温离心（3 000 r·min-1）15 min,取离心后血清置于离心管中，-80℃储存待测。取少量血清样品，按试剂盒说明书进行操作，对不同分组血清中LDH、CK、AST和ALT活性进行测定。

2.6 心肌组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量测定

制备组织样品匀浆液，适当稀释，用BCA试剂盒建立标准曲线，确定蛋白浓度。取少量样品按试剂盒说明书测定组织中SOD、GSH-Px活性以及MDA的含量。

2.7 大鼠心肌组织病理形态学观察

取出预保留的心肌组织部分浸泡于甲醛中，固定24小时后常规脱水，石蜡包埋，切片厚度为6 μm，进行HE染色，光显微镜下观察心肌组织的形态变化。

2.8 统计学处理

用SPSS17.0软件，对数据进行统计学处理，进行单因素方差分析，进行组间比较，结果以±s表示，P＜0.05为有显著性差异。

3 结果

3.1 大鼠心肌缺血再灌注损伤心电图ST段的变化

与假手术组相比，模型组大鼠在结扎后心电图上ST段抬高明显，且再灌注后仍升高（P＜0.01），模型建立成功。与模型组相比，当给予PNSSL 80、160 mg·kg-1浓度药物干预时，大鼠在再灌注后ST段逐渐恢复（P＜0.05），提示三七茎叶总皂苷能够改善由于缺血引起的心电图ST段的抬升，见表1。

3.2 心肌梗死面积

假手术组大鼠心肌组织经TTC染色呈现鲜红色，而模型组与给药组均呈现出不同程度的苍白色的梗死区域，如图1。结扎冠状动脉前降支后，模型组大鼠心肌梗死范围升高显著。PNSSL 40，80，160 mg/kg组及地奥心血康组均可降低心肌缺血模型大鼠的心肌梗死范围，其中给予PNSSL80，160 mg/kg剂量时降低显著(P＜0.05，P＜0.01)，见表2。

3.3 大鼠血清中心肌酶活性检测

由表3结果可见，与假手术组相比，模型组大鼠血清中心肌酶活性明显增加（P＜0.05），提示缺血再灌注大鼠模型对于心肌细胞细胞膜具有一定的损伤作用。当给予药物PNSSL时，大鼠血清中LDH、CK、AST、ALT活性均降低，其中给予PNSSL80、160mg·kg-1剂量时，CK、AST活性下降显著（P＜0.05）；PNSSL浓度为160 mg·kg-1时，LDH活性明显降低（P＜0.05），ALT活性随PNSSL给药剂量增加而呈现下降趋势。

表1 大鼠心肌缺血再灌注损伤心电图ST段的变化（±s）

表1 大鼠心肌缺血再灌注损伤心电图ST段的变化（±s）

注：与模型组相比较：**P＜0.01，*P＜0.05。

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3.4 心肌组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量测定

由表4结果可见，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性明显降低（P＜0.05），MDA含量略有升高。当给予药物PNSSL时，大鼠心肌中SOD、GSH-Px活性升高，其中给予PNSSL80 mg·kg-1剂量SOD、GSH-Px活性升高明显（P＜0.05），给予PNSSL不同浓度后，MDA含量呈降低趋势。

3.5 大鼠心肌组织病理形态学观察

镜下观察大鼠心肌组织切片，假手术组大鼠心肌组织结构基本无异常，心肌细胞排列比较整齐，横纹清楚。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，出现多处断裂，间质增宽水肿，局部呈现波浪形，可见多处变性坏死灶，胞质有溶解现象，程度较重，其结果见图2。给予PNSSL后，可见与模型组相比较，PNSSL各组变性坏死灶程度明显减轻，组织结构得到改善，其中PNSSL 80，160 mg·kg-1组大鼠心肌纤维排列较整齐，间质水肿减轻，提示PNSSL能够降低间质细胞浸润和心肌纤维紊乱，对于缺血再灌注损伤大鼠心肌具有明显的保护作用。

图1 大鼠心肌梗死面积

表2 三七茎叶总皂苷对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死范围的影响（±s）

表2 三七茎叶总皂苷对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死范围的影响（±s）

注：与模型组相比较：**P＜0.01，*P＜0.05。

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4 讨论

心肌缺血再灌注损伤已经成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，当恢复供血后会加重由于缺血造成的器官损伤，使可逆性损伤转为不可逆[17-20]，造成心脏舒缩功能抑制、细胞膜受损、心肌组织坏死等现象，这可能与能量代谢障碍、钙超载、炎性反应以及细胞凋亡等过程有关[21-22]。有研究表明，PNSSL可提高离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型下心肌组织中的SOD、GSH-Px活性，改善犬急性心肌梗死引起的血浆ET活性升高，降低血浆中TXB2水平，同时能够增加心肌血流量，改善心功能，具有一定程度的抗心律失常和抗心绞痛的作用。本实验通过结扎大鼠冠状动脉左前降支60 min再灌注45 min建立心肌缺血再灌注模型，以心电图ST段变化、心肌梗死范围、血清及组织中酶活性等作为PNSSL干预作用的评价指标，并结合病理形态学观察大鼠心肌组织，探索PNSSL对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

ST段的抬升作为心肌缺血的重要标志[23]，当心肌缺血60 min再灌注45 min后，模型组大鼠心电图ST段持续升高，提示模型对于大鼠心肌的收缩舒张功能具有一定的损伤。实验结果显示，PNSSL给药各剂量组大鼠心电图ST段在再灌注后均出现明显的下降趋势，提示PNSSL可改善由于缺血造成的心电图ST段升高，对再灌注后心电图ST段有明显的改善作用，具有提升心肌舒缩功能的作用。

心肌缺血再灌注损伤可通过多种因素造成心肌细胞受损和细胞膜通透性的增加，进而使得细胞内的标志性心肌酶LDH、CK、AST、ALT随心肌细胞破裂而释放出来，造成血清中活性升高。当给予PNSSL干预时，血清中LDH、CK、AST活性明显降低（P＜0.05），提示PNSSL可提高心肌细胞膜的稳定性，减少心肌酶的释放，避免心肌细胞的损伤。

SOD、GSH-Px是维持机体氧化平衡的重要物质，反应的是机体清除氧自由基的能力[24]。缺血再灌注后，模型组大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性明显降低，是由于机体长时间处于缺血状态后重新恢复供血或供氧，氧气大量增加而产生过氧化，使得氧自由基大量堆积进而造成组织损伤。实验中PNSSL组能够显著提升组织内SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，提示PNSSL可以提高机体抗氧化的能力，清除氧自由基，起到保护受损心肌的作用。

表3 三七茎叶总皂苷对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中心肌酶活性的影响（±s）

表3 三七茎叶总皂苷对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中心肌酶活性的影响（±s）

注：与模型组相比较：**P＜0.01，*P＜0.05。

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表4 三七茎叶总皂苷对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响（±s）

表4 三七茎叶总皂苷对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响（±s）

注：与模型组相比较：**P＜0.01，*P＜0.05。

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图2 大鼠心肌病理切片（HE×400）

心肌梗死范围的减小和心肌坏死程度的降低是评价药物对心肌缺血再灌注损伤保护作用的主要指标。实验中通过检测心肌梗死范围发现，与模型组相比较，PNSSL各剂量组能够明显降低心肌组织梗死面积，减少心肌组织损伤；同时心肌组织病理学检测显示，模型组大鼠心肌组织结构紊乱，出现多处断裂，间质水肿增宽，出现炎细胞浸润现象，可见多处变性坏死灶。而与