中药标准品对人肺癌耐药细胞A549/DDP的逆转效果研究＊

杨新阶，王婧筱，王 琳，迟笑怡，迟佳琦，周 天，刘铜华，胡凯文＊＊

（1.北京中医药大学 北京 100029；2.北京中医药大学肿瘤研究所 北京 100029；3.北京中医药大学东方医院 北京 100078；4.北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室 北京 100029）

肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤，其发病率和死亡率目前仍居高不下[1,2]。尽管以EGFR-TKIs为代表的靶向药物极大地改善了肺癌的治疗和预后，但化疗在临床治疗中仍然占据十分重要的地位，而化疗耐药的发生是导致临床治疗失败、疾病进展和预后不良的主要原因[3,4]。

肿瘤耐药发生的机制复杂，包括ATP结合盒转运体（ATP-Binding Cassette Transporters，ABCs）高表达、肺耐药相关蛋白（Lung resistance-related protein，LRP）表达上调、谷胱甘肽S转移酶（Glutathione-S-transferases，GSTs）作用增强以及DNA拓扑异构酶II（DNA topoisomerase II，Topo II）低表达等[5]。

在上述机制中，ABC的药物泵出作用最为重要，其逆转剂研究最为深入[6，7]。目前，第三代逆转剂Tariquidar专门针对ABC蛋白跨膜片段的半胱氨酸交联区并发挥作用[8]。据报道，A549/DDP耐药的发生可能与ABC家族中ABCB1和MDR1基因的高甲基化有关[9]。其产物为耐药相关的ABC蛋白，均为Tariquidar作用靶点。

Tariquidar开发伊始，因其在体内外试验的中良好耐受性和疗效而被寄予厚望[10]。但其临床试验均以失败告终[11]。肿瘤耐药的逆转药物开发进入了平台期。有数据显示，1999年至2008年的18年间，美国FDA批准上市进入临床的小分子化合物类药物中，36%为天然存在的化合物及其衍生物[12]。中药体系庞大，涵盖物质广泛，逆转肿瘤耐药的有效成也存在于中药之中[13]。

我们挑选既往报道具有逆转肿瘤耐药作用的5种中药标准品：川芎嗪、苦参碱、盐酸小檗碱、北豆根碱（蝙蝠葛碱）和冬凌草甲素等（表1）。这些标准品对白血病耐药细胞、胃癌耐药细胞、乳腺癌耐药细胞等均具有一定的逆转效果，但对于肺癌耐药细胞株的逆转作用尚不明确。本研究以人类肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP为模型，研究其对肺癌耐药的逆转效果，为解决临床肺癌耐药问题、开发新型耐药逆转剂提供初步依据。

表1 实验选择的中药标准品

1 实验仪器和材料

1.1 实验仪器

HERACell 150i恒温培养箱（Thermo scientific，USA），HDLDL-CJ-2ND I型洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）,Olympus IX7型倒置显微镜（Olympus，Japan），Sigma 3K15型低温高速离心机（Sigma，USA），Promega E9032型酶标仪（Promega，USA），Sartorius R200D 型 分 析 天 平（Sartorius，Germany），DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 实验材料

RPMI Medium 1640培养基(Invitrogen，USA)，胎牛血清（Gibco，USA），TRYPSIN-EDTA 胰酶消化液（Invitrogen），青霉素-链霉素混合液（Invitrogen，USA），磷酸盐缓冲液（PBS，Invitrogen，USA），25cm2细胞培养瓶（Corning，USA），15mL离心管（Corning，USA），Cell Counting Kit 8（CCK-8，Dojindo，Japan，批号：CK04-500）等。

1.3 药物与细胞

顺铂（DDP，Bioruler，USA，批号：RH66694-100 mg），Tariquidar（Selleck，USA，批 号 ：S8082），川 芎 嗪（Bioruler，USA，批号：RB14186-20 mg），盐酸小檗碱（Bioruler，USA，批 号 ：RB11146-20 mg），苦 参 碱（Bioruler，USA，批号：RB10662-20 mg），蝙蝠葛碱（Bioruler，USA，批号：RB15517-20 mg），冬凌草甲素（Bioruler，USA，批号：RB13949-20 mg）

人肺腺癌细胞株A549，购自ATCC上海细胞库，A549耐顺铂细胞药株（A549/DDP）购自北纳联创生物技术研究院（BeNa Culture Collection，北京）,该细胞株为A549细胞通过阶梯诱导法获得，历时12个月。以上细胞均储存于液氮存储系统之中。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将储存于液氮中的A549和A549/DDP细胞迅速置于37℃水浴锅中5 min内复苏。立即移入含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的1 640完全培养基中，反复吹打混匀，4℃，1 000rpm离心5 min后弃上清，加入5 mL 1 640完全培养基后混匀，移入25 cm2培养瓶，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。观察细胞生长情况，待A549细胞融合度达到80%以上时，用PBS清洗2次，加入1 mL胰蛋白酶消化，镜下观察细胞变圆时加入2 mL 1 640完全培养基停止消化，收集细胞置于15 mL离心管中，4℃，1 000 rpm离心5 min后弃上清，培养瓶传代培养。A549/DDP细胞融合度达到80%时，更换含5.67 μM（μ2 g/ml）DDP的完全培养液，部分细胞死亡漂浮，更换培养基继续培养，以维持A549/DDP对顺铂的耐药性。根据细胞生长情况进行传代，取对数期细胞进行实验，A549/DDP细胞实验前用不含DDP的培养基培养3天。

2.2 细胞标准曲线

为确定96孔板每孔细胞接种数量、贴壁孵育时间、加入CCK-8后的O.D.值读数时间等，需制作A549、A549/DDP细胞的增值标准曲线。将2株细胞分别梯度浓度接种于96孔板中（周围一圈孔加入PBS），设计梯度为：10 000、5 000、2 500、1 250、625/孔，贴壁生长24 h后加入CCK-8，间隔读取450 nm处的吸光值，间隔时间设计为15 min。分别以时间（min）为横轴、O.D.（450 nm）为纵轴制作曲线，以细胞浓度为横轴、O.D.（450 nm）为纵轴制作标准曲线，以此确定适宜的细胞接种数量和O.D.值读数时间。

2.3 A549/DDP耐药指数测定

取对数生长期的A549、A549/DDP细胞，按照每孔5 000个接种于96孔板中，培养箱贴壁生长24 h，加入梯度浓度含顺铂的1 640培养基。顺铂设计5个梯度浓度（每个浓度5个复孔）：A549细胞100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM；A549/DDP 细胞 2 560 μM、1 280 μM、640 μM、320 μM、160 μM。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，恒温箱孵育60 min，读取450 nm处O.D.值。根据CCK-8试剂盒说明计算细胞的活性及半数抑制浓度（Half inhibitory concentration，IC50）IC50。

耐药指数=IC50(A549/DDP)/IC50(A549)。

2.4 A549/DDP对中药标准品耐受实验

既往研究报道[14]，有机溶剂DMSO体积浓度＜0.1%或AEA体积浓度＜1%时，A549细胞增殖未见明显受益。但A549/DDP细胞对其耐受性并不明朗，本研究取0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%五个体积浓度梯度的二甲基亚砜（DMSO）和无水乙醇（AEA），用CCK8法确定A549/DDP对其耐受情况。

将选定的中药标准品溶解于不含血清的1 640培养基中，不溶于水的标准品加入DMSO或AEA助溶。等比梯度浓度配制工作液。取对数期A549/DDP细胞，5 000/孔接种于96孔板中，贴壁生长24 h后给予梯度浓度中药标准品溶液，恒温培养箱孵育24h，加入CCK8溶液，37℃孵育60 min后读取450 nm处吸光值。回归分析计算中药标准品对A549/DDP细胞的5%抑制浓度（5%inhibitory concentration，IC5）、10%抑制浓度（10%inhibitory concentration，IC10）以及 IC50。选取IC5作为逆转A549/DDP细胞耐药的工作浓度。

2.4 中药标准品逆转耐药实验

选取对数期A549/DDP细胞接种于96孔板中，贴壁后加入含有工作浓度中药标准品的1 640完全培养基，37℃恒温孵育24 h，弃去含药培养基，加入含梯度浓度顺铂的1 640培养基，孵育24 h后进行CCK8实验，计算IC50，对比逆转实验前后IC50值，计算逆转指数（Reversal Index）。除中药标准品之外，本研究以Tariquidar为阳性对照药，其工作浓度为1 μM，干预方法及CCK8实验同上。

2.5 数据分析方法

数据处理采用GraphPad Prism 7.0分析并作图，实验数据以平均数加减方差（±s）表示。多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验；P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著差异。

3 结果

3.1 标准曲线

A549/DDP是在A549细胞系基础上通过阶梯诱导传代获得的细胞株，经过长时间培养，有老化趋向，其代谢较A549细胞略缓慢（图1a）。根据标准曲线及吸光值，确定后续实验中96孔板接种细胞数目为5 000/孔，CCK8实验读数时间为60 min（图1b，c）。

图1 细胞增殖标准曲线

3.2 耐药指数

DDP对A549细胞的IC50为32.71±2.8 μM，DDP对A549/DDP 细胞的 IC50为 1040±30.1 μM，耐药指数（resistance index，RI）为31.79（图2）。

3.3 A549/DDP对中药标准品耐受

实验结果显示，有机溶剂助溶，DMSO的体积百分比＜0.1%或者AEA的体积百分比＜1%时，A549/DDP细胞增殖未见明显受抑（图3a）。故中药标准品溶液配制时，应将有机助溶剂的体积百分比控制在此范围之类，以免影响实验结果。

研究发现，A549/DDP细胞对川芎嗪（Tep.）和苦参碱（Mat.）耐受良好，高浓度下（500 μM）仍未见明显生长受抑，均选取100 μM作为工作浓度，其余中药标准品对A549/DDP细胞增殖的抑制效果（图3b）及确定的工作浓度见下表2。

3.4 逆转A549/DDP顺铂耐药

工作浓度中药标准品各组IC50与A549/DDP组比较具有显著性差异，说明其对A549/DDP细胞的耐药性具有不同程度的逆转作用。阳性对照药物Tariquidar(Tari.)的逆转效果与既往文献报道相近。（表3、图4）

图2 细胞对DDP的耐受情况

图3 A549/DDP对DMSO、AEA的耐受（a），盐酸小檗碱、北豆根碱（蝙蝠葛碱）和冬凌草甲素对A549/DDP细胞增的抑制作用（b）

表2 A549/DDP对中药标准品的耐受情况

4 讨论

肿瘤耐药的发生是多因素、多机制共同作用的结果[6]。主要包括：增强细胞膜上ATP依赖的泵蛋白（ABC蛋白）的表达，将细胞内的药物泵出；改变肿瘤细胞的药物吸收特性，减少抗肿瘤药物吸收；增加抗肿瘤药物的代谢速度；改变抗肿瘤药物的靶点；通过改变细胞周期检测点和影响凋亡通路阻碍细胞的死亡。Tariquidar能特异性地拮抗ABC转运通道，并在转录后水平下调耐药相关ABC的表达[15]。尽管如此，临床上肿瘤化疗耐药的现状仍旧未能得到丝毫的缓解。本实验中，Tariquidar对A549/DDP具有逆转效果（图4），提示其耐药机制可能与ABC高表达相关。而Tariquidar逆转以后的A549/DDP细胞仍具有一定的顺铂耐受性，说明其耐药性的发生可能是多因素作用的结果。

图4 中药标准品及阳性逆转剂对A549/DDP耐药逆转效果对比。

表3 中药标准品及阳性对照药物对A549/DDP耐药性的逆转效果

中药及复方被报道具有逆转肿瘤耐药活性由来已久[13,16]。川芎嗪能逆转血液肿瘤细胞K562和肝癌细胞HepG2对阿霉素的耐药性，其作用机制与川芎嗪下调ABCB1的表达有关[17,18]；苦参碱通过抑制P-gp蛋白表达、降低P-gp ATP酶活性来增加阿霉素在细胞内的蓄积，逆转膀胱癌细胞BIU-87和乳腺癌细胞MCF-7对阿霉素的耐受[19,20]；盐酸小檗碱不仅能通过下调P-gp的表达逆转血液肿瘤细胞K562的耐药性，而且还能通过下调Pho P和Pho R基因的表达逆转结核杆菌的细菌耐药性[21,22]；北豆根碱能通过抑制自噬溶酶体的降解增强Hela细胞对喜树碱的敏感性[23]；冬凌草甲素通过下调MDR1基因及P-gp的表达逆转胃癌细胞SGC7901、乳腺癌细胞MCF-7和血液肿瘤细胞K562的耐药性[24-25]。但是，这些药物对肺癌耐药的逆转作用及机制尚不明确。

本实验中所用细胞模型A549/DDP是在A549细胞系基础上，用DDP浓度递增法经过长时间诱导所获得。相比较于亲代细胞，A549/DDP在代谢和增殖速度上呈现出明显的老化趋势（图1）。经过长期的顺铂刺激，A549/DDP的耐药性也明显强于A549细胞系（P＞0.01）（图2）。本实验所选中药标准品中，川芎嗪和苦参碱的细胞毒性较弱，其余三种标准品均表现出剂量依赖的细胞毒性。中药标准品作用于A549/DDP的结果显示，所遴选的5种中药标准品均能有效逆转A549/DDP细胞的耐药性（与A549/DDP模型比较，P＞0.01）。为今后解决临床肺癌耐药、为开发出新的耐药逆转剂提供线索。efflux pump inhibitor.Expert Rev Anticancer Ther,2007.7(4):p.447-59.