成纤维细胞生长因子21抑制脂肪细胞中网膜素表达

2018-09-05赵妍妍梁向艳魏兰兰刘英光马鸣啸赵玉峰

基础医学与临床 2018年9期

陈镝，赵妍妍，梁向艳，魏兰兰，谢荣，刘英光，马鸣啸，赵玉峰

(西安医学院基础医学研究所，陕西西安 710021)

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)调节机体能量代谢，可降低血糖、改善脂代谢和减轻体质量。注射FGF21还可导致小鼠骨密度降低[1]。网膜素(omentin)是近来发现的一种脂肪因子，参与调节糖代谢，并影响心血管和骨组织的功能。网膜素水平与骨密度呈正相关，可减轻雌激素缺乏所致的骨密度减小，表明网膜素参与骨代谢的调控[2]。FGF21通过下调脂肪细胞的脂联素(adiponectin)表达而改善肥胖相关的糖脂代谢异常，提示FGF21通过调控脂肪因子表达来影响机体代谢。本研究检测了FGF21对3T3-F442A脂肪细胞的作用，可通过它的受体激活ERK1/2，进而抑制网膜素的基因表达。

1 材料与方法

1.1 材料:3T3-F442A细胞系(欧洲细胞保藏中心);FGF21(Peprotech公司)；胰岛素、地塞米松、 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和罗格列酮(Sigma-Aldrich公司)；DMEM培养基和胎牛血清(Invitrogen公司)；Real-time PCR检测用试剂(TaKaRa公司)；Western blot抗体(Cell Signaling公司);AZD4547、U0126(MCE公司)。

1.2 方法

1.2.1 3T3-F422A细胞的诱导分化：3T3-F422A细胞增殖至接触抑制2 d后，换至诱导分化液(DMEM+10% FBS+0.24 IU/mL胰岛素+2 μg/mL地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+50 μmol/L罗格列酮)培养2 d，随后换至维持液(DMEM+10% FBS+0.24 IU/mL胰岛素)培养2 d，之后换至完全培养液中(DMEM+10% FBS)培养6～8 d，当80%以上细胞出现脂滴时用于实验。

1.2.2 Real-time PCR检测网膜素mRNA表达：提取3T3-F422A细胞的总RNA，测定总RNA浓度和纯度后进行反转录，real-time PCR扩增。小鼠网膜素引物序列，上游引物：5′-TGCTACCAGAGGTTGCAGTG-3′，下游引物：5′-CTTGTGC CTTTGTGTGCTCC-3′。小鼠β-actin引物序列，上游引物：5′-CGTTGGCATCCACGAAACTA-3′，下游引物：5′-AGTACTTG CGCTCAGGAGGA-3′。反应体系20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、1 μL 上游引物、1 μL下游引物、2 μL cDNA、6 μL RNase-free ddH2O。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40个循环。用2-△△Ct法对基因相对表达量进行分析。

1.2.3 Western blot检测pERK1/2蛋白表达：提取3T3-F422A细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜孵育。漂洗后室温孵育辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗1 h。漂洗后使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统曝光检测，以β-actin作为内参，分析结果。

2 结果

2.1 FGF21和FGFR抑制剂对ERK1/2磷酸化的影响:FGF21使ERK1/2的磷酸化水平较对照组显著升高(P<0.05)。FGFR抑制剂AZD4547可显著回降FGF21对ERK1/2磷酸化水平的上调作用(P<0.05)(图1)。

2.2 FGFR和ERK1/2抑制剂对FGF21调控网膜素基因表达的影响:FGF21使网膜素基因表达较对照组显著下降(P<0.05)。FGFR抑制剂AZD4547和ERK1/2抑制剂U0126均可显著回升FGF21对网膜素基因表达的下调作用(P<0.05)(表1)。

3 讨论

网膜素参与骨代谢，其血浆水平与骨密度呈正相关。而FGF21易导致骨密度的下降，其机制尚不明确[3]。

本研究表明， FGF21可下调3T3-F422A脂肪细胞中网膜素的基因表达。FGF21结合FGFR后可激活脂肪细胞内信号分子ERK1/2。FGF21可使脂肪细胞内ERK1/2的磷酸化水平显著增强，而ERK1/2抑制剂可回降FGF21上调ERK1/2的磷酸化作用，从而证实FGF21在脂肪细胞中激活ERK1/2信号分子通路。