大黄素对小鼠的免疫调节作用及对脾细胞TNF-α和IL-10表达的影响

刘 超，高慧婕*，朱玉贞，董晓磊，崔 巍，王 北

(1.济宁医学院 药学院 基础医学教研室， 山东 日照 276826； 2.青岛大学 基础医学院 医学免疫学教研室，山东 青岛 266021； 3.济宁医学院 生物科学学院， 山东 日照 276826)

大黄为临床常用中药，其性味苦寒，具有泻下攻积、清热解毒、活血祛瘀之功效。其主要成分包括大黄素(emodin)、大黄酸、芦荟大黄素和大黄酚等[1]。大黄素(1,3,8-三羟基-6甲基蒽醌)是大黄的有效成分之一, 它具有显著的利尿[2]、抗菌抗炎[3-4]、抗癌[5]、保护肝肾[6-7]及免疫调节[8]作用。目前，有关大黄素的研究多集中于其抗炎、抗癌活性的研究，但其对免疫活性整体影响的研究甚少。本实验采用灌胃给药，应用环磷酰胺(cyclophosphamide, Cy)构建免疫抑制模型作为参照，从免疫器官、体液免疫功能、细胞免疫功能及细胞因子水平观察大黄素对小鼠免疫功能的影响及对炎性反应细胞因子的改变。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级ICR小鼠[济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号：SCXK(鲁)2014-0007]，6周龄，体质量平均为20 g，雌雄各半。大黄素(纯度≥96.0%，阿拉丁试剂有限公司)；10%聚羟基脂肪酸酯SRBC、环磷酰胺、绵羊红细胞PHA、Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇和反转录试剂盒(Thermo Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药：将雌雄对半小鼠随机分为对照组、环磷酰胺(Cy)组、大黄素高和低剂量组(10和5 mg/kg)，每组10只。每天以0.2 mL灌胃(大黄素组给药剂量按10和5 mg/kg计，余两组灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液)，共给药7 d。环磷酰胺组第2天和第4天分别注射0.1 mL环磷酰胺造模(每只动物环磷酰胺给药剂量按50 mg/kg计)，其余3组注射等剂量的0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 胸、脾指数的测定： 实验第7天，取小鼠胸腺和脾脏，测定胸(脾)指数。胸(脾)指数公式: 胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体质量(g)。

1.2.3 血清溶血素的测定： 实验第6天，每组小鼠腹腔注射10%的绵羊红细胞0.2 mL/只。实验第7天给药2 h后，眼眶取血，室温静置20 min，2 500 r/min 离心, 10 min，取稀释后的血清0.1 mL置于酶标板，加入等量的0.2% SRBC，随即加入豚鼠血清0.5 mL，放置于37 ℃恒温水浴箱中温浴1 h，冷却后2 000 r/min离心10 min。最后取上清150μL,放置于一个新的酶标板中，在450 nm下用酶标仪测定吸光度(A)值。

1.2.4 淋巴细胞转化实验： 实验第6天小鼠肌肉注射0.2 mL PHA(每只动物PHA给药剂量按8 mg/kg计)。实验第7天，给药2 h后，断尾取血，制片，瑞氏染色，每只鼠统计观察1 000个以上的细胞，计算淋巴细胞转化率。

1.2.5 ELISA检测小鼠外周血TNF-α和IL-10表达： 实验第7天，给药2 h后，眼眶取血，分离血清，依照ELISA试剂盒进行操作。酶标仪在450 nm条件分别测定IL-10及TNF-α的A值。

1.2.6 RT-PCR法检测小鼠脾细胞IL-10和TNF-αmRNA的表达： 实验第7天处死小鼠，取脾脏。将脾脏样本放入匀浆器内，迅速置于冰上研磨均匀，用Trizol 试剂提取脾细胞RNA，反转录为cDNA，PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94 ℃变性60 s、60 ℃退火70 s、72 ℃延伸90 s，共32个循环；72 ℃延伸7 min。扩增引物如下：IL-10(350 bp)上游引物：5′- ACTGGCATGAGGATCAGCAG -3′，下游引物：5′-AGAAATCGATGACAGCGCCT-3′；TNF-α(209 bp)上游引物：5′-ACCGTCAGCCGATTTGCTAT-3′，下游引物：5′-CCGGACTCCGCAAAGTCTAA-3′。GAPDH(183 bp)作为内参，上游引物：5′-ATTCA ACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物：5′-GCAGAA GGGGCCGGAGATGA-3′。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描分析DNA电泳条带吸光度值，以目的DNA电泳条带吸光度值与GADPH电泳条带吸光度值比值作为其表达参数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大黄素对小鼠免疫器官的影响

与对照组相比较，Cy组的胸(脾)指数明显缩小(P<0.01)；与对照组相比，大黄素高和低剂量组小鼠的胸(脾)指数降低(P<0.01)；大黄素对小鼠的免疫器官产生了一定的抑制作用，但其抑制效果不及环磷酰胺(表1)。

表1 大黄素对小鼠免疫器官的影响

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.05 compared with the Cy group.

2.2 大黄素对小鼠外周血T淋巴细胞转化率的影响

与对照组相比较，Cy组的淋巴细胞转化率明显降低(P<0.01)；与对照组比较，大黄素高和低剂量组小鼠淋巴细胞转化率均明显降低(P<0.01)，且高剂量组效果更为明显。大黄素对小鼠外周血淋巴细胞转化产生了一定的抑制作用，但抑制力不及环磷酰胺(表2)。

表2 大黄素对小鼠T淋巴细胞转化率的影响

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.05 compared with the Cy group.

2.3 大黄素对小鼠外周血溶血素产生的影响

与对照组相比，Cy组小鼠外周血溶血素的形成明显降低(P<0.01)；与对照组比，大黄素高和低剂量组均可促进小鼠外周血溶血素的形成，吸光度值(A)显著升高(P<0.01)，且高剂量组效果更为明显。说明大黄素提高了小鼠体内的抗体表达水平(表3)。

表3 大黄素对小鼠溶血功能的影响

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.01 compared with the Cy group.

2.4 大黄素对小鼠外周血TNF-α和IL-10表达的影响

与对照组相比，大黄素高或低剂量组均显著降低TNF-α的产生(P<0.01)，但效力不及Cy组；而其外周血IL-10的产生均有显著升高(P<0.01)，且高剂量组尤为显著，效力高于Cy组(表4)。

表4 大黄素对小鼠血清TNF-α、IL-10含量的影响

*P<0.01 compared with the control group；#P<0.05 compared with the Cy group.

2.5 脾细胞TNF-α和IL-10 mRNA表达的变化

大黄素组小鼠脾细胞TNF-αmRNA较对照组表达有所下降， 且不同剂量的大黄素均显著降低小鼠脾细胞TNF-αmRNA的表达。大黄素组小鼠脾细胞IL-10 mRNA 的表达较对照组显著升高(图1, 2)。

M.marker; C.control group; Cy.Cy group; L.emodin low-dose group; H.emodin high-dose group图1 RT-PCR测定TNF-α和IL-10 mRNA的表达Fig 1 Expressions of TNF-α and IL-10 mRNA detected by RT-PCR

1.control group; 2.Cy group; 3.emodin high-dose group; 4.emodin low-dose group; *P<0.01 compared with the control group图2 大黄素对小鼠脾淋巴细胞IL-10和TNF-αmRNA的影响Fig 2 Effect of emodin on the expressions of TNF-α

3 讨论

大黄对巨噬细胞的免疫活性具有双向调节作用，并且对TNF-α及某些白细胞介素类的细胞因子具有一定的抑制作用[9-10]。但是， 其重要活性成分大黄素对整体免疫活性机能影响的研究尚少。本研究利用正常小鼠和环磷酰胺免疫抑制小鼠分别作为阴性和阳性对照，从免疫器官、体液免疫功能、细胞免疫功能及炎性反应细胞因子水平观察大黄素对小鼠免疫功能的影响及其抗炎活性。实验结果表明，应用大黄素后，胸脾指数较正常对照组有一定程度的下降，同时降低了机体的淋巴细胞转化率，但效力不如环磷酰胺。而对外周溶血素的测定又显示大黄素可显著促进小鼠溶血素的形成，一定程度上增强了机体的体液免疫功能。

近年来的一些研究报道IL-10在不同的微环境中能够产生正、负两种调节：IL-10可以直接作用于CD4+T细胞，影响T细胞亚群的分泌和成熟，发挥负向调节作用；另一方面，IL-10可以增强其他特定细胞的免疫功能，例如促进B细胞分泌大量的IgM、IgG和IgA，抑制外周T细胞的凋亡[11-12]。本实验结果显示，应用大黄素后，外周IL-10含量以及IL-10 mRNA表达增加，尤以高剂量组增加显著。因此，有可能是IL-10的升高大大促进了血清中抗体的生成，提高了机体溶血素水平。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要由活化的单核/巨噬细胞产生，作为体内重要的炎性反应介质，在炎性反应中发挥重要作用[13]。本次实验结果显示，应用大黄素后，无论是在外周血中的TNF-α表达，还是脾细胞TNF-αmRNA的表达均呈现一定的抑制作用。说明大黄素能够降低机体TNF-α的表达，抑制炎性反应。

综上所述，大黄素作为一种临床常用的中成性药物的主要成分，在今后使用中，在考虑其抗炎疗效的同时，也同时应更加关注其对机体免疫功能的改变和调节，争取达到更加合理有效的用药。