倍半萜内酯减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗及早期肾损伤

邱 维，张 薇，陶建瓴，王海云，郑法雷，李雪梅

(中国医学科学院北京协和医院 肾内科，北京 100730)

近年来以胰岛素抵抗为特点的2型糖尿病发病率不断上升[1]。糖尿病肾病是发达国家最常见的终末期肾病病因，在中国患病率亦快速增长[2]。糖尿病肾病具体机制远未探明[3]，传统的降糖、降压、降脂无法从根本上改善糖尿病肾病的预后。近来慢性低度炎性反应在胰岛素抵抗的作用日益受重视[4]，能否通过抑制全身及肾脏局部慢性炎性反应、改善胰岛素抵抗，从而延缓糖尿病肾病进展是本研究拟探讨的问题。

倍半萜内酯/小白菊内酯(sesquiterpene lactones, pathenolide,PTN)是从菊科植物中提取的一种活性成分，可抑制NF-κB活性从而起到抗炎作用[5]。PTN 能否通过抑制炎性反应、改善胰岛素抵抗从而延缓糖尿病肾病进展目前尚未见报道。本研究以瘦素(leptin)受体基因缺陷导致的先天性2型糖尿病模型-C57BKS db/db小鼠为实验对象[6]，观察不同时间点小鼠代谢指标、慢性炎性反应和胰岛素抵抗以及肾脏损伤情况，以及糖尿病肾病机制及的倍半萜内酯治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级42只雄性C57BKS db/db小鼠与15只雄性db/m小鼠 [南京大学模式动物研究中心，SCKX(苏)2010-0001]，饲于北京协和医院动物研究中心，动物SPF级屏障环境，12 h 交替照明，随机分笼、颗粒饲料喂养、自由摄水。

1.1.2 药物与试剂：倍半萜内酯(parthenolide)(Sigma-Aldrich公司)； 兔抗鼠MCP-1(monocyte chemotactic protein 1)多克隆抗体(Abcam公司)； 羊抗鼠NF-κB多克隆抗体(Santa Cruz公司)；MCP-1、IL-6 ELISA试剂盒(Rapidbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 随机分组：1)对照组(db/m组，n=15)；2)实验组(db/db组，n=21)；3，干预组(db/db+PTN组，n=21)；3)db/db+PTN组于8周末起予PTN(1.0 mg/kg 隔日一次)腹腔注射，对照及实验组予0.9%氯化钠溶液隔日一次腹腔注射，分批于8、12及16周处死及留取标本。

1.2.2 标本留取及测定：以摘除小鼠眼球法留取血清，以酶法测定相关血清生化指标，以代谢笼收集24 h尿液，以免疫透射比浊法测定尿白蛋白，碘[125I]放射免疫法测定胰岛素，ELISA测定血清MCP-1、IL-6含量。计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS (mIU/L)/22.5，FBG为空腹血糖，FINS为空腹血胰岛素。取肝肾组织置于10%多聚甲醛固定，切片行HE染色，肾脏另行PAS染色。

1.2.3 肾脏免疫组化染色：选取图像导入Image-Pro Plus 6.0软件进行半定量分析，MCP-1：随机选取光学显微镜200×镜下15个视野的肾小管间质，分析每个视野的积分吸光度值(IA)，计算均值。NF-кB: 随机选取光学显微镜400×镜下20个视野的肾小球，随机取20个肾小球，分析每个视野下阳性染色细胞占肾小球细胞总数的百分比，计算均值进行比较。

1.2.4 肾脏PAS染色：应用ipp6.0软件处理，以db/db小鼠的单位肾小球面积(以ipp软件象素数目为面积单位)作为衡量肾小球肥大的指标，以db/db小鼠系膜基质积分吸光度值(IA)作为衡量系膜基质扩张的指标。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PTN改善小鼠生化代谢指标

16周db/db组较对db/m组出现肥胖、多食多尿及活跃程度偏低，质量、血脂、血糖升高、胰岛素分泌增加(表1，2)及脂肪肝程度加重。16周db/db+PTN组TC较db/db组显著下降(P<0.05)。

2.2 PTN改善小鼠全身胰岛素抵抗

16周db/db+PTN组小鼠的HOMA-IR较db/db小鼠有显著下降(P<0.05)(表3)。

2.3 PTN降低循环及肾脏炎性反应

2.3.1 循环炎性因子：12周db/db+PTN组小鼠的血清MCP-1与IL-6水平较db/db组显著下降(P<0.05)(表4，5)。

表1 16周龄小鼠糖代谢指标Table 1 Metabolic index in 16 week-old

#P<0.05 ompared with db/m group.

表2 16周龄小鼠脂代谢指标

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 ompared with db/db group.

表3 各组小鼠HOMA-IR指标

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group

表4 各组小鼠血清MCP-1变化

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

表5 各组小鼠血清IL-6变化

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

2.3.2 肾脏炎性因子：各周龄db/db组肾脏NF-кB阳性表达比例及MCP-1表达较db/m组均有显著上升。12周db/db+PTN组的NF-кB阳性表达比例较db/db小鼠显著下降(P<0.05)。12周db/db+PTN组的MCP-1表达较db/db小鼠显著下降(P<0.05)(图1)。

图1 各组小鼠治疗前后肾小球NF-кB阳性染色情况Fig 1 NF-кB positive proportion in glomerular before and after treatment

#P<0.05 compared with db/m group; *P<0.05compared with db/db group图2 各组小鼠治疗前后肾小球NF-кB阳性比例Fig 2 NF-кB positive proportion in glomerular before and after treatment

#P<0.05 compared with db/m group; *P<0.05compared with db/db group图3 治疗前后MCP-1阳性区域IA值Fig 3 A value of MCP-1 positive region before and after treatment

图4 各组小鼠肾小管MCP-1组化染色Fig 4 MCP-1 staining of renal tubules in each group of mice

2.4 PTN改善小鼠脂肪肝及糖尿病肾病预后

2.4.1 肾脏生化指标：db/db组U-ACR显著高于db/m组(P<0.05)。db/db+PTN组与db/db组相比，尿量、血肌酐、U-ACR无差异(表6)。

2.4.2 肝脏病理：db/db小鼠存在严重的肝脏脂肪化；经PTN治疗后16周小鼠肝脏脂肪化程度减轻，肝小叶大部分细胞未见严重空泡样变，细胞肿胀程度减轻，排列较为规则(HE×200)(图5)。

表6 16周小鼠生化指标Table 6 Biochemical indexes in16 week-old mice

#P<0.05 compared with db/m group.

图5 16周小鼠PTN治疗前后肝脏病理Fig 5 Liver pathology in 16 week old mice before and after PTN treatment

图6 16周各组小鼠肾脏PAS染色Fig 6 Pathological changes of kidney in 16 week-old mice before and after PTN treatment(PAS)

2.4.3 肾脏病理：PAS(×200)染色下，16周db/db组肾组织光镜下可见肾小球肥大、系膜基质扩张及染色加深。db/db+PTN组肾小球肥大及系膜扩张较db/db组减轻(图6)。

db/db组肾小球面积在各时间点显著大于db/m组(P<0.05)，16周db/db+PTN组的单位肾小球面积较db/db组显著下降(P<0.05)(表7)。

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

db/db组系膜基质IA值在各时间点显著高于db/m组(P<0.05)；db/db+PTN组的系膜基质IA值较db/db组在12周、16周显著下降(P<0.05)(表8)。

表8 各组小鼠系膜基质IA值

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

3 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病的突出特征，与慢性非特异性炎性反应有密切关联[4]。高脂血症、高血糖、氧化应激可导致炎性反应信号通路在脂肪组织中的活化[7]，目前针对炎性因子相关的药物干预,许多已被证实可改善糖尿病肾病预后[8-9]。

在NF-κB信号通路中，IκK可使IR与IRS-1 Ser磷酸化[10]，而下游TNF-α、IL-β1、IL-6均可通过各自途径，同样可阻碍正常的IRS-1酪氨酸磷酸化而导致胰岛素抵抗[3-11]。本研究中12周 db/db+PTN组的血清MCP-1与IL-6水平较db/db组显著下降，证实PTN也可减少循环中NF-κB以外的炎性因子。肾脏局部炎性因子与循环因子有相似之处[12]。db/db+PTN组的肾脏NF-κB与MCP-1表达水平下降；其HOMA-IR在12、16周较db/db组有下降趋势，进一步证实了胰岛素抵抗改善与炎性反应抑制相关。而在16周db/db+PTN组的肾小球肥大及系膜基质扩张有所改善，说明PTN可引起慢性炎性反应抑制及胰岛素抵抗改善，进而延缓糖尿病肾病的病理进展。本研究中db/db鼠MCP-1与IL-6的指标在12周达峰后、于16周却有所下降。这也是引起16周db/db+PTN组炎性因子改善不明显的原因之一。另外，db/db小鼠的血糖及胰岛素水平随周龄增长，至10～12周进入平台期，此时肾脏仅有早期系膜扩张及基质增生，至24周db/db小鼠肾脏病理电镜下才可出现线粒体变形、脂滴减少、细胞核变形、染色质边集等异常[6]。因此抑制炎性反应的益处可能需要更长时间积累才可充分体现。

脂类代谢异常被认为是影响胰岛素信号转导的重要环节。肝脏脂质异位积累可损害胰岛素的调节能力、激活糖异生和糖原的合成[13]。db/db+PTN组小鼠TC水平有所下降、脂肪肝程度减轻。这说明PTN对减轻脂代谢异常从而改善胰岛素抵抗可能有积极作用。在肥胖的小鼠，脂肪细胞可分泌大量MCP-1，作为一种趋化因子募集巨噬细胞到脂肪组织，加剧慢性炎性反应的进展[12-14]。从机制上看，小鼠肝脏脂肪组织中的炎性反应与巨噬细胞的作用可能相关。本研究主要着眼于肾脏疾病及预后，其肝脏局部机制仍有待于进一步试验研究。