老年散发性结直肠癌中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表达及与预后的相关性

张良良， 宋 蒨，石红建，任景丽，卞晓星

近年来结直肠癌的发病率与死亡率上升至第3位和第4位[1]。结直肠癌总数的95%[2]左右为散发性结直肠癌(sporadic colorectal carcinoma,SCC)。SCC中15%是由错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白表达缺失而引起的[3]。MMR基因的功能在于维持基因复制的准确性，翻译正常的错配修复蛋白，发挥抗肿瘤作用，如其发生突变或甲基化，致癌基因将得到聚集，导致肿瘤发生[4]。随着人口老龄化，老年SCC患者不断增多，且SCC患者中现仍以老年人为主[5]，但MMR在老年SCC中的研究则较少，老年SCC患者中MMR的具体作用需要进一步的分析研究。基于此，该研究将探讨老年SCC患者中MMR蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6的表达及与预后的相关性，旨在为老年SCC患者的诊疗及对预后的估计提供参考依据。

1 材料与方法

1.1病例资料筛选从2009年6月～2012年6月江苏大学附属武进医院病理科SCC术后的标本，共232例，分为老年组152例(年龄≥65岁)，非老年组80例(年龄<65岁)。老年组患者年龄65～86(73.71±7.63)岁，非老年组患者年龄30～59(46.8±8.56)岁。入组标准：① 所有患者具有完整的临床信息；② 术前均未进行放、化疗；③ 均经术前及术后病理检查，明确诊断为SCC；④ 分期均为Ⅱ-Ⅲ期，分期符合美国癌症联合委员会(AJCC)第七版分期标准[6]。其中Ⅱ期结肠癌患者包括以下至少一项高危因素：组织学分化差﹙Ⅲ或Ⅳ级)、标本检出淋巴结不足(少于12枚)、T4、脉管浸润、术前肠梗阻或肠穿孔；⑤ 化疗方案均应用FOLFOX方案。

1.2方法在MMR系统中，MMR基因主要依赖hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白发挥作用[7]，因此采用免疫组织化学方法测定上述蛋白的表达情况。步骤：将标本用40 g/L的甲醛固定，石蜡包埋，按5 μm的厚度连续切片，用PV-9000二步法，常规HE染色，于组织细胞状态较好处，用免疫组织化学法染色，一抗为hMLH1、hMSH2、hMSH6鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物有限公司)，阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照。以正常结直肠黏膜上皮或浸润的淋巴细胞为阳性对照。

1.3结果判定结果判断标准：① 按将阳性细胞所占的比例进行评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>76%为4分；② 将染色程度进行评分：棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，无色为0分；染色程度评分和阳性细胞的比例评分的乘积≥2分，判定为MMR蛋白表达正常，<2分判定为表达缺失。以正常的结直肠黏膜上皮核染色作阳性对照。hMLH1、hMSH2、hMSH6均表达正常判定为表达正常(proficient mismatch repair，pMMR)，否则判定为表达缺失(deficient mismatch repair，dMMR)。

1.4随访每3～6个月对患者进行一次随访；随访内容包括：治疗方案、是否复发、复发时间、生存时间等。随访截至日期为2017年6月，随访时间为11～60个月。

1.5统计学处理应用SPSS 21.0软件对资料进行分析。计数资料比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法对生存时间曲线进行绘制，并以Log-rank检验进行比较。单因素及多因素分析采用Cox比例风险模型，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MMR蛋白的表达情况老年组共有26例MMR蛋白表达缺失，缺失率为17.71%(26/152)；非老年组共有21例MMR蛋白表达缺失，缺失率为26.25%(21/80)，两组相比，差异无统计学意义(P=0.100)。见图1。

图1 MMR蛋白免疫组织化学图 ×100A：hMLH1蛋白；B：hMSH2蛋白；C：hMSH6蛋白；1：表达正常；2：表达缺失

2.2MMR蛋白表达与SCC患者临床病理特征的关系老年组：dMMR组患者和pMMR组患者在分期、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移方面差异有统计学意义(P<0.05)；与pMMR组相比，dMMR组患者更多见于高分化、Ⅱ期、肿瘤直径≥5 cm的患者，更难发生淋巴结转移。非老年组：dMMR组患者和pMMR组患者在分期、分化程度、淋巴结转移方面差异有统计学意义(P<0.05)；与pMMR组相比，dMMR组患者更多见于高分化、Ⅱ期的患者，更难发生淋巴结转移。见表1。

2.3MMR表达与SCC患者预后的关系老年组：dMMR组的5年生存率为84.62%(22/26)，高于pMMR组56.35%(71/126)，差异有统计学意义(χ2=9.001，P=0.003)。非老年组：dMMR组的5年生存率为80.95%(17/21)，高于pMMR组49.15%(29/59)，差异有统计学意义(χ2=6.991，P=0.008)。见图2。

2.4单因素和多因素分析单因素分析结果显示：

表1 MMR表达缺失组和MMR表达正常组患者临床病理特征比较(n)

图2 SCC患者dMMR组与pMMR组生存时间比较A:老年组；B:非老年组

表2 影响患者生存时间的单因素 COX 回归分析结果

RR：相对危险度

表3 老年组生存时间的多因素 COX 回归分析结果

RR：相对危险度

表4 非老年组生存时间的多因素 COX 回归分析结果

RR：相对危险度

MMR状态、肿瘤分化程度、组织学类型与老年组和非老年组患者预后显著相关(P<0.05)。多因素分析结果显示：MMR状态、分化程度为影响老年组患者生存时间的独立因素(P<0.05)；MMR状态、组织学类型为影响非老年组患者生存时间的独立因素(P<0.05)。见表2～4。

3 讨论

结直肠癌的发病率及死亡率呈逐渐上升的趋势，其中MMR基因的突变或甲基化导致结直肠癌的发生，这一途径越来越受到重视。MMR基因的正常表达，可识别并纠正错配的碱基，保持基因转录翻译的稳定性，避免肿瘤的发生[8]。随着人口老龄化和医疗水平的提高，老年SCC患者的数量越来越多，研究MMR在老年SCC患者中的作用显得非常重要。老年组MMR蛋白表达缺失率为17.71%，低于非老年组的26.25%，或许是因为非老年组样本量较少的原因，差异无统计学意义，但可反映这有可能是SCC患者年轻化趋势的原因之一。相关研究[9]表明，MMR蛋白的表达状态与SCC患者的临床病理特征有明显的相关性。本研究显示，在老年SCC患者中，dMMR组患者更多见于Ⅱ期、高分化、肿瘤直径≥5 cm的患者，更难发生淋巴结转移。dMMR组的患者发生淋巴结转移的比例要比pMMR组低，这与Park et al[10]的研究结果一致，这或许是dMMR组患者预后较好的原因之一。

与pMMR组患者相比，dMMR组患者更多为Ⅱ期、高分化的肿瘤，早期及高分化的肿瘤，预后往往较好，这些均可能是dMMR组患者预后更好的原因。dMMR组患者更多为体积较大的肿瘤(直径≥5 cm)，这些患者由于肿瘤体积较大，发生腹痛、排便习惯改变等临床症状和肠穿孔、肠梗阻、出血等并发症的时间较早，更早地发现、及时治疗意味着更好的预后。对于非老年组患者，MMR表达状态与患者的分期、分化程度、淋巴结转移方面显著相关，与肿瘤直径无明显相关性，这与老年组患者不同。研究[11]表明，MMR蛋白与SCC患者的生存时间有明显的相关性。Zaanan et al[12]认为，dMMR患者的生存时间显著长于pMMR患者，FOLFOX辅助化疗有益于dMMR患者。也有一些学者认为，含5-Fu的化疗方案对dMMR患者无明显的作用[13]。本研究显示，MMR蛋白表达缺失是老年SCC患者预后好的指标，Cox回归分析结果表明：MMR状态为影响SCC患者生存时间的独立因素。两组患者均于术后应用FOLFOX方案进行化疗，结果dMMR组的5年生存率高于pMMR组，差异有统计学意义。因此，对于伴有高危因素的老年Ⅱ-Ⅲ期SCC中MMR表达缺失的患者，建议应进行术后辅助化疗。对于MMR影响SCC患者预后的具体机制，仍未完全阐明，有多种观点。Scarpa et al[14]认为，相比MMR蛋白表达正常的SCC患者，MMR蛋白表达缺失的SCC患者中，免疫监视功能明显增强，可显著影响患者的预后。Zhang et al[15]则认为dMMR结直肠癌的免疫微环境与pMMR的不同。

本研究未将MMR蛋白表达状态分别与Ⅱ期、Ⅲ期SCC患者的临床病理特征及预后的关系进行研究，有待大规模、更为细致的研究验证上述结论。

综上所述，老年SCC患者MMR蛋白的表达状态与其临床病理特征及预后有明显的相关性，dMMR组患者更多见于Ⅱ期、高分化、肿瘤直径≥5cm的患者，更难发生淋巴结转移。MMR状态为影响老年SCC患者预后的独立因素，dMMR组患者较pMMR组患者预后更好。