Survivin基因在胃癌癌前病变不同中医证型中的表达

付兆媛 汪龙德 毛兰芳

通过检测胃癌癌前病变患者三种不同中医证型（脾虚气滞证、阴虚内热证、胃络瘀阻证）胃黏膜组织中抑癌基因Survivin的表达。探讨中医证型与Survivin表达之间的相关性。方法：实验分为对照组和试验组。对照组为24位健康体检者的正常胃组织标本，试验组为不同中医证型组（脾胃虚弱证、阴虚内热证、胃络瘀阻证）。故共有4组（健康对照组、脾胃虚弱证组、阴虚内热证组、胃络瘀阻证组）；每位患者取新鲜胃黏膜6块进行HE染色、免疫组化及RT-PCR。结果：Survivin基因阳性表达在脾虚气滞证中有30.0%，阴虚内热证中有38.3%，胃络瘀阻证中有31.7%，健康对照组无表达；Ⅰ型肠化生无表达，Ⅱ型肠化生表达2.63%，Ⅲ型肠化生表达39.47%。异型增生表达10.53%。结论：胃黏膜组织凋亡相关基因Survivin基因的表达与胃癌癌前病变病理类型有关，而且在胃癌癌前病变不同中医证型的表达有统计学意义。可为胃癌癌前病变的中医证型客观化提供依据。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在各种恶性肿瘤中发病率排在第二位，在我国每年新增癌症中位居第四位，是一个严重影响国人健康的公共卫生问题。而在甘肃省特别是武威地区胃癌的发生率又明显高于全国水平，因此胃癌诊治一直是我院消化内科研究的重点。国内外大多数学者认可的胃癌发病模式为：萎缩性胃炎一肠化生一异型增生一胃癌。众所周知，目前医学的发展对中晚期胃癌治疗效果仍不理想，所以早诊早治，是提高胃癌存活率的唯一有效措施。而对胃癌的早期诊治主要依赖于对胃癌前期变化进行早期干预治疗。胃癌癌前变化包括癌前状态和癌前病变。癌前状态为临床概念，指胃癌前期疾病，如慢性萎缩性胃炎等。癌前病变（PLGC，Preca-ncerous lesions of gastric carcinoma）为病理概念，包括肠化生（Intestinal metap-lasia，IM）、不典型增生或称异型增生（Dysplasia，Dys）。现代医学对PLGC的逆转或阻断效果不佳，中医药强调治未病、未病先防，针对其病因病机，运用辨证论治的特点，采用药物、针灸、穴位贴敷等综合治疗，在改善临床症状，改善和逆转胃黏膜病变有显著优势。本研究旨在探讨胃癌癌前病变患者中医分型与Survivin表达的相关性，为临床的辨证治疗提供一定的帮助，并有可能为中医规范化辨证治疗提供具体的量化指标。

一、资料与方法

（一）一般情况

收集2015年1月至2016年12月甘肃中医药大学附属医院门诊及住院PLGC患者120例，其中男性76例，女性44例，年龄36～76岁，平均年龄为56.48岁。其中年龄/>60岁33例，<60岁87例；门诊健康体检者24例作为对照组，其中男性15例，女性9例，平均年龄53.24岁，男女比例在性别年龄上无统计学意义（p>0.05）。

（二）诊断标准

1.西醫诊断标准：

（1）临床表现：主要症状主要表现为非特异性消化不良，上腹部胀满不适、疼痛；可伴有食欲不振、嘈杂、恶心、反酸、暧气、口苦等症状，少数患者还可有乏力、消瘦、健忘、抑郁、焦虑等全身甚或精神症状。

（2）病理诊断标准：

肠腺化生：胃黏膜表层上皮细胞中出现分泌酸性黏液的杯状细胞，有纹状缘的吸收上皮细胞和潘氏（Paneth）细胞等。肠化生上皮有杯状细胞和吸收上皮细胞者称为完全化生，只有杯状细胞者为不完全化生。不完全化生中又可根据其黏液组化反应，氧乙酰化唾液酸阳性者为大肠型不完全化生，阴性者则为小肠型不完全化生。不完全性大肠型化生与肠型胃癌的发生关系密切。

异型增生：指胃黏膜上皮和腺体的一类偏离正常分化，形态和机能上呈异型性表现的增生性病变。可发生在胃小凹上皮和肠化生处，具有较高的癌变倾向，但无间质侵犯。国际上通行的做法是分为低、高两级别，高级别异性增生癌变率高。

2.中医证型标准：

依据《中药新药临床研究指导原则（试行）》，（1）脾胃虚弱证：胃痛隐隐，绵绵不休，时轻时重，喜温喜按，空腹痛甚，得食则缓，乏力纳差，舌淡苔白，脉细弱。兼有气滞证：胃脘痞满，呕吐，恶心，暖气等症。（2）阴虚内热证：胃脘隐隐灼痛，嘈杂，饥不欲食，烦渴思饮，口燥咽干，食少，大便秘结，舌红少苔，脉细数或细弦。（3）胃络瘀阻证：胃脘痛如针刺或刀割，痛处固定，拒按，舌质紫暗或瘀斑，脉涩。

（三）病例选择标准

1纳入标准

（1）符合西医临床诊断和病理诊断标准，经胃镜检查病理诊断为肠化生和不典型增生；（2）符合中医证型诊断标准。中医证型属于脾胃虚弱证、阴虚内热证、胃络瘀阻证其中一种者；（3）受试者年龄在30～80岁之间；（4）无合并严重心脑血管疾病及全身器质性疾病；（5）向患者交代研究过程，取得同意签署知情同意书。

2.排除标准

（1）心、肝、肾功能明显异常；（2）急性胃炎、慢性胃炎（浅表性或者萎缩性无肠型化生及无异型增生的胃炎）、胃癌及转移癌的患者；（3）中医证型两型并见无主次之分或三型并见证型复杂者；（4）资料不全或不完整者。

（四）实验分组

本实验分为对照组和试验组，对照组为24位健康体检者的正常胃组织标本，实验组为不同中医证型组（脾胃虚弱证、阴虚内热证、胃络瘀阻证）。

（五）实验方法

与纳入标准相符的患者签署胃镜检查（取活检）知情同意书，每位患者取胃体、胃窦和胃角的胃黏膜各2块，组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋及切片，进行HE染色及免疫组化。

免疫组化法步骤：①取用4%多聚甲醛固定的胃黏膜组织进行石蜡包埋；②玻片捞取切片，恒温箱60℃烤片过夜；③二甲苯及梯度酒精常规脱蜡至水；④0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）热修复抗原；⑤3%H2O2灭活；⑥滴加5%BSA封闭液孵育，滴加稀释的一抗4℃过夜；⑦滴加二抗及SABC，37℃孵育15分钟；⑧DAB显色10分钟，苏木素复染5分钟，盐酸酒精脱分化；⑨脱水，透明，中性树胶封片，显微镜观察。病理医师进行染色结果判断，阳性反应判定标准：Survivin基因表达为胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性颗粒，少部分也可见于细胞核，阳性细胞占10%以上为阳性表达，<10%为阴性。

RT-PCR技术步骤：①于一周内取-80℃储存的胃黏膜组织提取RNA；②将RNA反转录DNA；③将酶、水、DNA中的目的基因、引物，依次加入PCR仪进行扩增；④跑胶：电泳仪中跑胶，检测PCR产物。

引物序列及扩增条件

根据基因序列设计人Survivin引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

CCK引物序列：F：5′ATGGCC-GAGGCTGGCTTCATCCAC3′，R：5′TTGTAGTTTGTGCTATTCT-GTGAATTA3′，产物长度304bp，扩增条件：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃30s，72℃60s，35个循环，72℃7min。

β-actin引物序列：F：5′AA-CACCCAGCCATGTACGTTG′，R：5′ CGGATGTCCACGTCA-CACTTCAT′，产物长度509bp。GAPDH退火温度60℃，30个循环。

（六）统计学处理

所有数据均在SPSS19.0软件包下进行分析，多组资料阳性率（%）的比较采用卡方检验（x2检验），并采用Bonferroni法进行组间多重比较分析，显著性检验水准α=0.05，p<0.05差异具有统计学意义。

二、结果

（一）PLGC病理类型与中医证型的关系

120例PLGC患者中医分型脾胃虚弱证、阴虚内热证、胃络瘀阻证分别为36例，46例，38例，IM在脾虚气滞证、阴虚有热证、胃络瘀阻证中分别有7例、9例、6例，Dys在脾虚气滞证、阴虚有热证、胃络瘀阻证中分别有5例、10例、11例，而同时有IM和Dys分别有24例、27例、21例。IM、Dys、IM&Dys在各组间的比较无统计学意义，见表1。

（二）survivin在不同病理组织中的表达

Survivin基因在120例PLGC病例中阳性表达38例（31.67%），其中在肠腺化生中表达16例（42.11%），异型增生22例（57.89%），在Ⅰ型肠化生中无表达，Ⅱ型肠化生中表达1例（2.63%），Ⅲ型肠化生中15例（39.47%），异型增生轻度表达4例（10.53%），異型增生重度18例（47.37%）。Ⅲ型肠化生和重度不典型增生与其他组比较有显著性差异（P<0.01），但两组间比较无统计学意义（p>0.05），健康对照组、Ⅰ型肠化生、Ⅱ型肠化生、轻度不典型增生组间比较（p>0.05），无统计学意义（见表2）。

（三）Survivin在PLGC不同中医证型胃黏膜的表达

1.免疫组化法SP法检测Sur-vivin的表达

从表2可以看出，脾虚气滞证、阴虚有热证、胃络瘀阻证胃黏膜survivin基因蛋白表达阳性者分别为4例（11.11%）、14例（30.43%）和20例（52.63%），脾虚气滞证与对照组比较无明显差异（p>0.05），阴虚有热证较脾虚气滞证和对照组明显增高，差异有统计学意义（p<0.05）。而胃络瘀阻证较脾虚气滞证和对照组明显增高，差异有统计学意义（p<0.01）。胃络瘀阻证与阴虚内热证比较，差异有统计学意义（p<0.05）（见表3）（附图）。

2.RT-PCR技术检测Survivin-的水平

由图1、2示对照组、各证型组β-actin mRNA均有表达，而Sur-vivin mRNA在a、b道无表达，c、d道有表达，c、d与对照组Survivin mR-NA的表达有显著性差异（p<0.01）。

三、讨论

祖国医学中并没有“胃癌前期变化”这一病名，根据其胃脘痞满、疼痛、食欲减退、暧气、泛酸等临床症状特征，可将其归于中医“胃痛”“痞证”等范畴。本病病位在胃脘，病变脏腑主要在脾胃，早在《内经》中对上述疾病的病因病机就有论述，其病因主要与饮食不节、嗜好烟酒、情志不节、郁思恼怒、素体虚弱、劳倦内伤、或用药不当、久病体虚等有关。对于该病的辨证分型，各个医家认识虽有不同，但基本同意湿热内蕴是其常见证型，如杨维佳等选择了近5年来50篇辨证治疗慢性萎缩性胃炎的临床研究文献，共计5107例，辨证分型共29型，其中肝胃不和型939例；胃阴不足型902例；中虚气滞型844例；脾胃虚寒型418例；脾胃虚弱型411例；脾胃湿热型268例；其余分型所占比例都在5%以下。李卫强[8-9]从络病论治胃癌前病变，认为阴血不足，络脉瘀滞在胃癌前病变的形成中起到关键作用。他指出Hp感染是癌前病变的发病关键。中国中西医结合研究会消化系统疾病专业委员会于2011年10月在天津最后讨论审定了《慢性胃炎中西医结合诊疗共识意见》将本病分为六型：肝郁气滞、肝胃郁热、脾胃湿热、胃络瘀阻、脾胃虚寒及胃阴不足证。总之大多中医专家均认为慢性萎缩性胃炎的病因病机复杂，其产生主要为“毒邪”所致，致病因素中的物理、化学等因素均属于“毒邪”范畴且人体内的湿热、瘀血等病理产物日久可生毒。我院在古方“平胃散”的基础上进一步研发的院内制剂中成药“平胃胶囊”，疗效颇丰。经过大量临床、实验研究证实，其可以清除Hp，改善PLGC黏膜炎症，促进萎缩腺体的恢复，并在一定程度上可以治疗、改善胃黏膜的肠化生或不典型增生，一定程度上达到预防胃癌发生的目的。因此中医证型及中医药对PLGC的研究具有必要性。

胃癌的演变是一个多基因、多步骤、多途径参与的复杂生物学过程。在此过程中有多种基因发生结构和表达的异常，涉及多种癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、细胞黏附分子及DNA修复基因等的异常积累。Survivin基因是1997年由耶鲁大学Altieri等发现的一种抗凋亡因子，是凋亡抑制因子家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）的新成员。Kania等报道，在正常的胃黏膜中survivin mRNA有极低度表达，但无survivin蛋白表达。在癌组织和癌前组织中，survivin mRNA和蛋白的表达均显著升高；survivin由于其特殊的作用及特异性的组织分布，以及其抑制细胞凋亡的功能活性，使其在肿瘤的发生、发展中起着关键性作用。已被视为早期胃癌诊断和治疗的重要靶点。PTEN是一种肿瘤抑制基因，可以抑制肿瘤细胞浸润转移，加速细胞凋亡，阻止细胞增殖；当PTEN表达减弱或缺乏时，可使胃黏膜上皮易于发生恶性转化，在胃癌发展中起一定作用。PTEN通过刺激CDX-2启动子转录活性增强CDX-2的表达，提示在肠上皮化生至肠型胃癌的转变中PTEN对CDX-2的表达可能起到一定的调节作用。实验研究证明survivin是STAT3信号通路的一个下游基因，STAT3-Survivin信号通路等各种信号传导通路与肿瘤关系的密切。同时Survivin与PTEN均参与细胞周期调控和细胞凋亡，在胃癌的发展中发挥协同效应，两者作用环节一致，但生物学效应相反。随着癌前病变向胃癌的发展，Survivin基因表达增高，而PTEN蛋白表达减低，Survivin与PTEN在异型增生和胃癌组织中的表达存在负性相关。

本研究从Survivin在胃癌癌前病变不同中医证型中的表达及在不同病理类型中的表达进行了研究，结果显示它们之间存在相关性，在阴虚内热证、胃络瘀阻证、Ⅲ型肠化生、异型增生中Survivin基因的阳性表达率明显升高，说明癌变的概率较高，临床治疗中应对此类疾病更加重视。PLGC发病机制复杂，课题组从Survivin基因作了初步的研究，希望能够为临床提供更准确的立法方药，为提高临床疗效提供科学的依据。因此，从中医药入手防治胃癌癌前病变，阻止其向胃Ca发展，是减少胃Ca发生率的有效措施。