甲基纳曲酮对肝癌HepG2的VEGF的mRNA表达的抑制作用

伍天影 阮林

【摘要】目的：观察甲基纳曲酮对肝癌HepG2细胞VEGF的mRNA的影响。方法：分别将含0.01μmol甲基纳曲酮（低剂量组）、0.05μmol（中剂量组）、0.1μmol（高剂量组）培养基与肝癌HepG2细胞共孵72h，以等体积生理盐水处理组设立空白对照组。应用RT-βCR检测肝癌HepG2细胞中VEGF基因表达水平。结果：RT-βCR显示，甲基纳曲酮高剂量处理组作用72h的胞VEGF在mRNA水平表达均较对照组下调，低浓度组、中浓度组、高浓度组分别为0.75±0.03，0.58±0.05，0.47±0.04，各组均与对照组相比具有显著性差异（F=107.9，p=0.000），且具有时间依赖关系。结论：甲基纳曲酮能够下调肝癌HepG2细胞VEGF在mRNA的表达。

【关键词】肝癌；甲基纳曲酮；mRNA；血管内皮生长因子

肝癌是全球第五大癌症，其死亡率排世界第二m在肝癌的分型中，原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）占据了90%以上，因其高发率和异质性引起广泛关注Iz]在癌症患者自觉症状中，癌性疼痛是癌症患者常出现的主要症状之一，晚期癌症患者中有70%～90%者伴有不同程度癌痛，其中中度疼痛占50%，重度疼痛占30%[3]。甲基纳曲酮（MNTX）是首个用于泻药治疗OIC无效时用于临床的阿片类药物拮抗剂。而本篇着重探讨甲基纳曲酮肝癌HepG2细胞VEGF的mRNA的影响，对肝癌患者的治疗及疼痛管理将有所参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肝癌细胞株HepG2由广西医科大学附属肿瘤医院中心实验室提供。血清购于gibco公司。DMEM培养基购自gibco公司。逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo公司。TRIzol Reagent购自Invitrogen公司（美国）；PCR primer廣州艾基生物合成，并PAGE纯化。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HepG2人肝癌细胞培养于含10%胎牛血清DMEM培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养、传代。

1.2.2 荧光定量

PCR检测VEGF mRNA表达水平。以0.01μmol甲基纳曲酮、0.05μmol甲基纳曲酮、0.1gmol甲基纳曲酮作用于肝癌HepG2细胞，同时以等体积生理盐水处理组为空白对照组。各组分别培养72h后，以Trizol法提取细胞总RNA，测RNA含量、浓度。按逆转录试剂盒说明书进行操作，获得cDNA。荧光定量PCR用SYBRGreen染料为荧光检测信号，荧光实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR）在八联管中反应，每组每个基因设3个复孔。RT-qPCR引物见表to反应条件：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火并延伸30s，共40个循环。数据采用2-△△Ct法进行分析。每次实验设3个副孔，重复3次。

2 结果

2.1 肝癌HepG2细胞VEGF的检测结果

作用72h后肝癌HepG2细胞的VEGF在mRNA水平表达低浓度组、中浓度组、高浓度组相对表达量分别为0.75±0.03、0.58±0.05、0.47±0.04。各组均与对照组相比具有显著性差异（F=107.9，p=0.000），且具有时间依赖关系。

3 讨论

癌症所致的疼痛极大地降低了癌症患者的生存质量。因此疼痛需要规范的治疗[4]。阿片类药物导致的胃肠道功能障碍主要由于μ阿片受体作用于胃肠道导致，最常用的减轻阿片类药物性便秘的是使用通便的泻药，但使用不当时很可能无效[5]。阿片类受体拮抗剂作为治疗OIC的药物的发展。这些阿片受体拮抗药物可以特异性结合μ阿片受体的外周阿片受体，从而有效地制约了胃肠道外周作用。甲基纳曲酮在临床上是一种广泛使用的阿片类受体拮抗药，常用于使用阿片类药物治疗癌痛和术后镇痛导致的便秘并且不影响其中枢镇痛作用。有研究表明甲基纳曲酮对于前列腺癌具有一定的抑制作用，其在肝癌中的作用还未见报道。

VEGF是一种肝素结合内皮细胞生长因子，对血管内皮细胞生长因子特定体内能诱导血管生成[6]有研究表明相比较于肝癌患者的VEGF（-）/（+）群体，VEGF（++）/（+++）群体在有远处转移，血管侵犯，AFP>400ng/m占据的比例显著更大，且VEGF的过表达与患者的转移，血管侵犯，生存率有关[7]。荧光定量PCR检测，作用72h后肝癌HepG2细胞的VEGF在mRNA水平表达低浓度组、中浓度组、高浓度组分别为0.75±0.03、0.58±0.05、0.47±0.04，各组均与对照组相比具有显著性差异（F=107.9，p=0.000），且具有时间依赖关系。甲基纳曲酮可以下调HepG2人肝癌细胞的VEGF在mRNA水平上的表达。本研究为临床上在治疗肝癌患者时应用甲基纳曲酮提示了方向。

（通讯作者：阮林）

参考文献

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[3]Swarm，R.A.，et al.，Adultcancer pain.d Natl Compr Cane Netw，2013.11（08）：p.992-1022.

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[7]Choi，S.B、，et al.，VEGFOverexpression Predicts PoorSurvival in HepatocellularCarcinoma.Open Med（Wars），2017.12：p.430-439.