人NSD2基因特异性shRNA慢病毒载体构建及沉默效果评价

王红红 潘云 李艳

【摘要】目的：构建针对人NSD2基因的shRNA慢病毒载体，并观察其在人肾293T细胞中沉默效果，从而为进一步研究NSD2基因在其他肿瘤细胞系中的表达及影响莫定基础。方法：以NSD2基因为靶标，设计并合成2条互补寡核苷酸序列（NSD2 shRNA-1，NSD2 shRNA-2）克隆至PLKO-βuro重组慢病毒载体中，形成新的重组慢病毒载体PLKO- NSD2-puroe然后与包装质粒PMDL、PV5VG、PREV在 293T细胞中进行包装，产生重组慢病毒颗粒，并进一步感染293T细胞，通过提取蛋白进行Western Blot检测NSD2基因沉默效果。结果：通过PCR鉴定和DNA测序鉴定证明NSD2 shRNA-1，NSD2 shRNA-2重组shRNA慢病毒表达质粒中插入了目的DNA片段。且通过Western Blot检测NSD2基因沉默效果，证明了NSD2 shRNA构建效果不错，可以进一步运用于与NSD2相关的肿瘤细胞细胞系中。结论：成功构建了人的NSD2基因shRNA真核表达的慢病毒载体，为进一步应用于其他与NSD2相关的癌细胞系，针对NSD2基因的肿瘤治疗研究莫定基础。

【关键词】NSD2：shRNA：慢病毒：载体构建：293T细胞

NSD2又称MMSET（multiple myelomaSET domain）或者WHSC1（Wolf- Hirschhorn syndrome candidate 1），位于染色体4p16.3上，是NSD蛋白家族的重要成员之一[1]。研究发现NSD2基因的表达水平与多种肿瘤的发生发展密切相关。比如，最初发现的因NSD2单倍体计量不足导致的以脑部发育过小和智力发育迟缓为特点的沃尔夫综合征（Wolf Hirschhornsyndrome）[2]。研究显示NSD2在多类肿瘤中存在高表达，且与多种肿瘤的发生及恶性程度有关[3]如：淋巴系统肿瘤[4]，骨肉瘤[5]，乳腺癌，胰腺癌等。且研究显示NSD2在神经母细胞瘤[6]，结腸癌，肺癌等多种肿瘤中存在过表达[1]，提示NSD2有潜在的致瘤作用，表明NSD2可作为相关肿瘤诊断的理想标志物[1，7]且NSD2的致癌作用首先在MM（Mutiple Myeloma，多发性骨髓瘤）中证实的[8]，t（4；14）（p16；q32）易位是MM中最常见的易位之一，与MM的不良预后有直接关系[8，9]。多项研究报道，NSD2的过表达在有t（4；14）（p16；q32）易位的MM病例中普遍存在，并成为这种亚型MM的一个关键致癌因素[10]。shRNA（shorthairpin RNA）的发现，已成为特异性抑制基因快捷高效表达的一种技术手段。且近年来慢病毒载体表达的shRNA介导的基因沉默被广泛应用于基因研究，药物靶点的筛选等。因此为更好的研究NSD2蛋白在基因区分部特点，以及NSD2基因与其他基因的相关性，进一步分析NSD2的转录活性，本研究从shRNA入手，构建了针对NSD2基因的shRNA慢病毒干扰载体，并将该基因的沉默作用侵染到293T细胞中，并为进一步分析NSD2基因在其他肿瘤细胞系中的表达机制提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人肾293T细胞株，TRC2-βLKO-βuro慢病毒表达载体质粒，大肠杆菌DH5a感受态细胞，慢病毒包装质粒PMDL.PV5VG、PREV全都由中国科学院生物物理研究所李国红研究员实验室馈赠。

1.2 方法

1.2.1 人NSD2基因靶向shRNA序列的设计与合成

在NCBI网Gene数据库搜索得到人NSD2基因mRNA序列（Gene ID：NM-001042424.2-CCDS33940.1）的转录本，PCR引物设计按照shRNA的设计原则，参照人NSD2基因序列完整的转录本1（NM-001042424.2），再根据TRC2-βLKO-βuro载体的特点（图1）。酶切位点为Kpn1与ECOR1，设计合成2对shRNA单链寡核苷酸片段（表1）。将设计的引物发送至上海生工生物有限公司合成，得到干粉oligoDNA，先用ddH2O配置成100uM的溶液。然后引物退火：shRNA#1/2 F/R（100um）各取10ul，5XGC buffer 8ul，ddH2O 12ul共40ul，

沸水（100℃）域煮5min后，用一个烧杯连同引物加水一块取出，室温下使引物自然冷却，即可形成双链的shDNA。

1.2.2 NSD2-shDNA片段与PLKO-βuro表达载体的构建

将TRC2-βLKO-βuro载体分别用Kpn1与ECOR1进行双酶切，体系为TRC2-PLKO-βuro载体质粒3ug，限制性内切酶Kpn1与ECOR1分别1ul，10X buffer 3ul，ddH20补足至30ul。然后将NSD2-sbDNA片段与PLKO-βuro表达载体连接。连接体系：T4酶0.5ul，载体V（PLKO）0.5ul，10XT4 buffer 2ul，Insert（退火后引物稀释10倍用）1ul，ddH2O 16ul共20ul。16℃连接过夜。

1.2.3 重组NSD2-shRNA干扰表达质粒的鉴定

将连接产物转化至大肠杆菌DH5a。取80ul混匀的菌液，均匀涂布于含Amp+100ug/ml的LB固体培养基中，37度培养过夜至长菌。然后随机挑取3个单克隆菌落，分别接种于4ml含50ug/ml的氨苄青霉素LB液体培养基中，恒温37℃摇床，200rpm/min震荡摇过夜。次日用生工小提中量质粒提取试剂盒提质粒，并送北京美吉生物测序。测序引物为人的U6通用引物。测序结果与引物序列比对，比对结果（如图2）。

1.2.4 病毒侵染建立稳定细胞系

1.2.4.1 慢病毒包装 （1）当293T细胞生长密度至细胞基区的65-70%时，开始转染细胞。 （2）取1.77ug shRNA载体质粒、1.152ugpMDL质粒、0.62ugpVSVG质粒和0.469ug pREV质粒到一个新的1.5ml无菌EP管中与DMEM共250ul混合均匀，另一管lout的biotool溶液与DMEM共250ul混合均匀，室温放置5min后，将上述的两管溶液在室温下混合均匀，在室温静置20min。全部转移至待转染细胞的细胞培养皿中混匀，将细胞放入培养箱中培养。 （3）转染6-7小时后，用新鲜培养基，给已转染的细胞换液并继续培养。

（4）转染48小时后将含有病毒颗粒的细胞培养基上清液转移至新的15ml无菌离心管，再在细胞培养皿中加入3ml新鲜培养基继续培养。

（5）24h后再次收取细胞培养基上清，与前次收取的含有病毒颗粒的细胞培养基合并，室温下2000rpm，离心5min，用滤器过滤上清液到新无菌管中。

1.2.4.2 用慢病毒侵染细胞 （1）将待侵染的细胞传代至3.5cm细胞培养皿中，当细胞贴壁时，吸弃细胞培养基。并将病毒悬液滴加在细胞表面，加入0.5ul 10mg/ml polybrene后混匀，37℃恒温箱培养。 （2）侵染8小时后吸弃细胞培养皿中的液体，加入2ml新鲜的细胞培养基继续培养。 （3）在细胞生长为80%，将细胞传代至6cm细胞培养皿。细胞生长到80%细胞培养皿时，继续传代。

（4）24小时后，用加相应抗生素的培养基換液，大约7天后，存活下来的即为被慢病毒成功侵染的细胞。

1.2.5 Western Blot检测NSD2基因沉默是否构建成功。

培养72h后收细胞。用500ul的RIPI裂解液（50mMTris：150mM Nael，0.5%TrionX-100；0.1 %DOC，1mMEDTA）同时加入蛋白酶抑制剂终浓度为（1mM PMSF，1000Xleupeptin，1000X Aprotinin）水浴超声裂解细胞提取蛋白。加5XSDS loading终浓度为2X，100℃煮样15min。Westem Blot检测，先将蛋白定量，10% SDS-βAGE电泳跑胶，湿转（360mA，90min）转移至NC膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1小时。敷一抗（NSD2 ab75359 1：1000；Tubulin 1：5000），4℃孵育过夜，用1：10000的HRP标记的抗鼠二抗室温孵育1小时。洗膜TBST洗5次/7mino化学发光试剂盒显影。

2 结果与分析

2.1 NSD2-shDNA片段与PLKO-βuro表达载体的构建鉴定

针对NSD2构建的2种shRNA-NSD2-PLKO-βuro表达载体经测序验证，结果表明插入的核苷酸序列完全正确无突变碱基（图2），证实成功构建2个针对NSD2基因的shRNA干扰表达载体。将两个质粒分别命名为shRNA-NSD2-βLKO-1和TshRNA-NSD2-βLKO-2。

2.2 Western Blot检测逆转录病毒转染的人NSD2基因沉默效果

将shRNA-NSD2-βLKO-1与shRNA-NSD2-βLKO-2干扰质粒通过慢病毒侵染后建立稳定细胞系，以未转染的293T细胞，以及shRNA-NSD2-βLKO-1与shRNA-NSD2-βLKO-2瞬时转染293T细胞的样品作为对照组。Western Blot结果显示瞬时转染的NSD2表达抑制有所下降，通过慢病毒侵染建立稳定细胞系的NSD2表达基本全部沉默。图3。

3 讨论

NSD2（MMSET或WHSC1）是一类组蛋白赖氨酸甲基转移酶，能催化H3第36位发生二甲基化（H3K36rne2）[11]，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[5，12]。研究表明NSD2的高表达对基因的影响可能涉及：P53通路；NF-KB通路；整合素通路；细胞周期调控机制；c-MYc的表达等[7，13，14]。并且NSD2与淋巴系统肿瘤等多种肿瘤中都存在表达的异常，与肿瘤的发展及预后密切相关。因此研究NSD2在基因区的表达水平，对探究肿瘤的特异性靶点以及相关抑制剂的研究具有重要临床意义。

NSD2作为重要的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，在国内研究还比较少。因此为进一步阐明人NSD2基因的功能及表达，本研究成功构建了2个人NSD2基因的shRNA干扰表达载体shRNA-NSD2-βLKO-puro。通过Western Blot检测慢病毒侵染的人NSD2基因沉默效果表明，对照组NSD2蛋白的表达与shRNA-NSD2-βLKO-Puro慢病毒侵染的NSD2蛋白表达水平有显著差异。表明构建的2个shRNA真核表达载体能有效抑制293T细胞中NSD2的表达。表明其下调人NSD2基因表达。其中以慢病毒侵染的shRNA NSD2沉默效果最佳。总之，本研究成功构建了2个针对人NSD2基因的shRNA干扰表达载体，可显著降低293T细胞中 NSD2基因的表达，为进一步研究NSD2基因在其他癌细胞系中的表达及影响机制奠定了基础。

参考文献

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