甘草甜素对脂多糖诱导的大鼠心肌炎的保护作用

林怡瑄，郑子赫，林悄响，温智渊，贺 蛟，方秋娟

心肌炎是心肌的一种炎症性疾病，可表现为急性、亚急性或慢性进程，可伴有心肌的局灶性或弥漫性病变，可有全身疲劳、不适、胸痛、心源性休克、心律失常，甚至心搏骤停等临床表现［1］。心肌炎初期表现隐匿，在青壮年的猝死原因中占比达20%［2］。有研究报道，黄芪、丹参等部分中草药可改善病毒性心肌炎所致的心律失常和心肌酶谱异常［3］。甘草是药食兼用的补益中草药，甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是其最主要的生理活性物质，属三萜衍生物，广泛用于治疗各种急慢性肝炎、支气管炎和艾滋病，并有助于减轻缺血心肌损伤［4－6］。本实验采用GL干预脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的大鼠心肌炎模型，旨在为应用GL防治心肌炎提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠33只，体质量（190±10）g［福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（闽）2010－0001］。饲养期间，按标准要求维持环境的温度及湿度等，提供足够的饲料和饮水。实验操作遵循动物伦理法规条例。

1.1.2 试剂 GL（纯度98%，韶关市冠翔生物制品有限公司）；LPS（美国Sigma公司）；微量还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）及过氧化氢酶（catalase，CAT）测试盒（南京建成科技有限公司）；10%中性甲醛固定液（北京雷根生物技术有限公司）；Masson三色染色试剂（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.1.3 仪器 离心机（TDL－60B，常州市飞鸽医疗器械有限公司）；酶标仪（Elx800，美国BioTek公司）；透射电镜（EM208，荷兰飞利浦公司）。

1.2 方法

1.2.1 制备LPS诱导的大鼠急性心肌炎模型SD大鼠33只，随机分成3组（n＝11）：对照组（CON）、心肌炎模型组（MM）及 GL 治疗组（MM＋GL）。CON组大鼠给予尾静脉注射生理盐水1mL／kg，其余2组注射 LPS（每周0.2mg／kg，连续4周，方法参照文献［7］）；之后再给各组大鼠灌胃，其中CON组及MM组每天灌以生理盐水10mL／kg，MM＋GL组每天灌以 GL 200mg／kg，连续4周。

1.2.2 检测大鼠血清及心肌抗氧化代谢指标 按照试剂盒说明，测血清CAT活性；制备心肌组织匀浆，测心肌组织的MDA，GSH和SOD含量。

1.2.3 H－E染色观察心肌组织学结构 取左心尖部心室内膜下心肌组织，固定、脱水、包埋，制作心肌组织病理学切片。常规H－E染色，光镜下观察摄影。

1.2.4 Masson染色观察心肌组织胶原纤维 将上述制备的心肌组织病理学切片，按Masson染色试剂盒说明书进行染色，光镜下观察摄影。

1.2.5 透射电镜观察心肌细胞超微结构 取左心尖部心室内膜下心肌标本，切成1mm3大小的组织块，按常规进行前固定、后固定、脱水、浸透、包埋、聚合、修块、半薄切片、定位、切片、染色，透射电镜下观察摄影。

2 结 果

2.1 GL干预对心肌炎大鼠心肌和血清指标的影响 MM组的GSH含量及CAT活性低于CON组（P＜0.05），MDA及SOD含量与CON组差别无统计学意义（P＞0.05）。MM＋GL组的GSH高于MM组（P＜0.05），MDA，SOD 及 CAT 含量与MM组差别无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 GL干预对炎症大鼠心肌组织MDA，SOD，GSH含量和血清CAT活性的影响Tab 1 The effects of GL on myocardium MDA，SOD，GSH and serum CAT activity in myocarditis rat model

2.2 GL干预对炎症大鼠心肌组织结构的影响H－E染色结果显示，CON组心肌纤维完整、致密、粗细一致，心肌细胞核形态正常；MM组心肌组织间隙增宽，毛细血管扩张充血，炎症细胞浸润，水肿明显，心肌纤维松散，粗细不均，部分肌纤维断裂、溶解，细胞核扁平；MM＋GL组心肌组织结构基本正常（图1）。

图1 GL干预对炎症大鼠心肌组织结构的影响（H－E染色）Fig 1 The effects of GL intervention on myocardial structure in myocarditis rats（H－E staining）

2.3 GL干预对炎症大鼠心肌纤维化的影响Masson染色观察大鼠心肌组织胶原纤维，CON组及MM＋GL组心肌组织均未见明显胶原纤维；MM组可见明显的胶原纤维（图2）。提示心肌炎模型组大鼠心肌纤维化，而GL干预可防止大鼠心肌组织纤维化。

2.4 GL干预对炎症大鼠心肌细胞超微结构的影响 透射电镜观察结果显示，CON组细胞核轮廓清晰，形态正常；线粒体丰富，可见线粒体嵴；肌原纤维排列整齐，Z线明显，可见M线，肌小节、肌丝形态完整。MM组细胞核轮廓不清，核周池肿胀；线粒体少，排列零乱，呈固缩状态，或崩解消失，嵴模糊不清；肌原纤维呈波浪状，肌丝溶解，模糊不清，Z线迂曲。MM＋GL组心肌细胞核、线粒体、肌原纤维结构正常（图3）。

3 讨 论

LPS是革兰阴性细菌细胞壁的外膜成分，其释放量的多寡决定了机体产生炎症反应的类型，可用于诱导制备炎症模型［8］。LPS进入血液循环后，首先与LPS结合蛋白和细胞表面的CD14分子结合，再与单核－巨噬细胞膜上Toll样受体4结合，导致TLR4聚合而活化。LPS还可激活丝裂原激活的蛋白激酶通路，导致炎症细胞因子大量产生和释放［9］。

图2 GL干预对炎症大鼠心肌纤维化的影响（Masson染色）Fig 2 The effects of GL intervention on myocardial fibrosis in myocarditis rats（Masson staining）

图3 GL干预对炎症大鼠心肌细胞超微结构的影响Fig 3 The effects of GL intervention on ultra－structure of myocardial cells in myocarditis rats

本研究显示，成年大鼠尾静脉间断性注射低剂量LPS（每周0.2mg／kg，连续4周）后，心肌 GSH显著降低、心肌SOD和血清CAT活性降低、心肌纤维松散和胶原纤维增多、心肌细胞超微结构异常，提示LPS造成大鼠心肌抗氧化能力降低、结构损伤和心肌纤维化。

既往研究也表明，GL可减轻柯萨奇病毒B3引起的小鼠心肌炎，但其治疗剂量范围窄［10－11］。本研究每天以GL（200mg／kg）干预炎症性大鼠，结果显示，该剂量GL可增强心肌的抗氧化能力，并维持心肌结构正常。

适量的GL可能通过以下机制介导对大鼠心肌炎症性疾病的保护作用：（1）GL改善大鼠心肌炎症性疾病模型的抗氧化代谢：机体炎症时自由基代谢异常，自由基化学性质极为活泼，有强氧化作用，可引发脂质过氧化反应。生理状况下，自由基的生成和清除维持动态平衡，当平衡被打破时，自由基在体内大量堆积，造成组织的损伤。MDA是脂质过氧化产物，可损伤细胞膜；SOD广泛存在于生物体内，能催化O2－歧化反应，保护细胞不受自由基伤害［12］；CAT广泛存在于人体内，催化过氧化氢分解为水和氧气，使H2O2不与O2在铁螯合物作用下反应生成－OH［13］；GSH能与机体内的自由基结合，清除自由基，为细胞提供抗氧化保护［14］。本研究提示，LPS造成大鼠心肌抗氧化能力降低，GL可明显提高心肌GSH含量，减轻心肌MDA的升高和SOD的降低程度及增加血清CAT活性。说明GL可通过改善机体的抗氧化代谢，保护心肌防止炎症损伤。（2）GL减轻心肌纤维化程度：心肌细胞为终末分化细胞，损伤后以纤维细胞进行修复。本研究显示，LPS造成心肌组织损伤，胶原纤维增多；GL灌胃可保护心肌，减轻纤维化程度，从而改善心功能。（3）GL保护线粒体：线粒体是细胞有氧呼吸的场所，呼吸链对维持基本生命体征有重要意义。本研究显示，MM组心肌线粒体结构模糊和溢出，MM＋GL组心肌线粒体结构维持正常。

综上所述，每天给予GL（200mg／kg）可保护心肌结构，防止炎症损伤，其机制与GL增强机体抗氧化能力有关，但其效应规律还有待于今后进一步研究。