体外培养大鼠颌骨成骨细胞成骨及成血管相关因子表达检测

陈玉玲，许雄程，阳 雪，吴玉铭，何梦娇，3，骆 凯，3

正畸治疗涉及牙槽骨的骨改建。在压力侧，多核破骨细胞数量增加，出现骨吸收陷窝，牙槽骨将被吸收；而在张力侧，成骨细胞功能活跃，表现为新生骨组织的形成［1］。近年来，骨改建中血管生成的意义越来越受学者们的重视。已有研究证实，血管生成和骨改建共同进行并相互影响，新生血管可加速新骨的形成，在骨改建过程中发挥重要作用［2－3］。成骨细胞作为骨改建过程中的重要细胞，不仅是骨组织矿化的主要细胞，还可调控骨组织的血管化［4－5］。本研究拟通过体外培养大鼠颌骨成骨细胞，初步探讨体外培养过程中颌骨成骨细胞的成骨及成血管相关细胞因子的表达情况，为深入研究颌面部骨改建过程中成骨细胞对血管内皮细胞的调控机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级SD大鼠，体质量（100±20）g［福建医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK（闽）2012－0001］。

1.1.2 试剂 DMEM 低糖培养液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清 （fetal bovine serum，FBS）（美国Hyclone公司）；胶原酶、抗坏血酸、β－甘油磷酸钠、茜素红S、地塞米松（美国Sigma公司）；链霉素、青霉素、碱性磷酸酶检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol?Reagent（美国 Life Technologies公司）；荧光定量聚合酶链反应试剂盒、反转录试剂盒（日本Takara公司）；大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），血管生成素－1（angiopoiettin－1，Angpt－1），成纤维生长因子－2（fibroblast growth factor，FGF－2）酶联免疫吸附 检 测 试 剂 盒 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。

1.1.3 仪器 细胞培养箱（HF240型）、生物安全柜（7BZ－ZHF1200A2）［中国力新仪器（上海）有限公司］；超净工作台（SW－CJ－1B，苏州净化设备有限公司）；倒置荧光相差显微镜（IX－71，日本Olympus公司）；实时荧光定量 PCR仪（LightCycler 480，德国Roche公司）；高速离心机（SABOFUGE400R，德国Heraeus公 司）；酶 标 仪 （BIO－RADiMark，美 国Bio－Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠颌骨成骨细胞分离培养 参照文献［6］的方法，大鼠经腹腔注射100mg／kg氯胺酮麻醉处死，分离下颌骨获取皮质骨，经PBS反复清洗后修整成1～2mm大小骨块。37℃下胰蛋白酶（0.25%）孵育10min，胶原酶（0.1%）消化30min。弃上清，继续消化1h，收集上清液，离心后弃上清。经DMEM低糖培养液（含10%FBS、100U／mL青霉素、100U／mL链霉素）重悬后接种于培养瓶，置于培养箱中常规培养。原代细胞90%融合后进行消化传代。选择P3以内细胞进行实验。

1.2.2 大鼠颌骨成骨细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色 大鼠颌骨成骨细胞接种于24孔板内，接种密度为每孔2×104个。细胞接种1d后更换为成骨诱导液（50mg／mL抗坏血酸、10mmol／L地塞米松和2mmol／Lβ－甘油磷酸钠）。诱导培养7d，用95%乙醇固定后进行ALP染色。

1.2.3 大鼠颌骨成骨细胞矿化结节检测 大鼠颌骨成骨细胞接种于6孔板内，接种密度为每孔1×105个。细胞接种1d后更换成骨诱导液，连续诱导培养14d后进行茜素红染色检测矿化结节。

1.2.4 大鼠颌骨成骨细胞成骨及成血管相关基因mRNA检测 大鼠颌骨成骨细胞接种于6孔板内，接种密度每孔1×105个。成骨诱导培养3，7d后弃培养液，参照Trizol试剂盒说明提取总RNA并逆转录为cDNA。按试剂盒说明书，实时荧光定量聚合 酶 链 反 应 （real－time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测 ALP，VEGF，FGF－2和Angpt－1Runt相关转录因子2（runt－related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙素（osteocalcin，OC）、Ⅰ型胶原α1（collagen type I alpha 1，Col－Ⅰα1）的表达，以 GAPDH 为内参，2－ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.5 大鼠颌骨成骨细胞成血管相关细胞因子的蛋白水平测定 大鼠颌骨成骨细胞接种于6孔板内，接种密度为每孔1×105个。成骨诱导培养3，7d后分别收集上清液。采用ELISA试剂盒检测上清液中 VEGF，FGF－2和 Angpt－1的含量。

2 结 果

2.1 大鼠颌骨成骨细胞原代培养 颌骨骨组织消化液接种24h后，可见个别散在细胞贴附于培养瓶底部。随着培养时间的延长，贴壁细胞增多，细胞可为梭形、三角形或多边形，可见圆形或卵圆形胞核（图1A）。体外培养12d，细胞即可达90%融合进行传代。选择3代以内的细胞进行实验。

2.2 大鼠颌骨成骨细胞鉴定 成骨诱导培养7d，ALP染色可见体外培养的大鼠颌骨成骨细胞胞质内有棕黑色颗粒状集簇（图1B）。连续诱导培养14d，细胞融汇成多层，重叠生长，局部聚集形成矿化结节。经茜素红染色，矿化结节可着色，呈橘红色（图1C）。

图1 大鼠颌骨成骨细胞原代培养与鉴定Fig 1 Primary culture and identification of rat mandibular osteoblasts

2.3 成骨及成血管相关基因表达检测 大鼠颌骨成骨细胞体外培养，随着培养时间的延长，成骨相关基因 ALP，RUNX2，OC和 Col－Iα1的 mRNA 表达水平均显著增高（P＜0.05，图2）。相应的成血管相关基因 VEGF，FGF－2和 Angpt－1的 mRNA 表达也显著增加（P＜0.05，图3）。

图2 大鼠颌骨成骨细胞成骨基因mRNA水平Fig 2 Expression of osteogenesis－related gene in rat mandibular osteoblasts

图3 大鼠颌骨成骨细胞成血管相关基因mRNA水平Fig 3 Expression of angiogenesis－related gene in rat mandibular osteoblasts

2.4 成血管相关细胞因子的表达检测 ELISA结果表明，体外培养的大鼠颌骨成骨细胞，随着培养时间的延长，细胞上清液中成血管相关细胞因子VEGF，FGF－2 和 Angpt－1 的 表 达 均 显 著 增 加（P＜0.05，图4）。

图4 成血管相关细胞因子的含量Fig 4 Concentration of angiogenesis－related cytokines

3 讨 论

骨改建涉及多细胞单位（basic multicellular unit，BMU）内多种细胞间的相互作用和调控过程［7］。成骨细胞作为BMU中的主要功能细胞，其与血管内皮细胞间的相互作用已成为学者们研究的重点［4－5，8］。本研究选择体外培养早期的时间点初步探讨颌骨成骨细胞分化过程中成血管相关因子表达的情况。结果发现，体外培养的颌骨成骨细胞在成骨相关基因表达增加的同时，其成血管细胞因子VEGF，Angpt－1和FGF－2在mRNA及蛋白水平均显著提高。该研究结果提示，成骨细胞在成骨分化早期，可通过分泌 VEGF，Angpt－1和FGF－2等细胞因子参与新骨形成过程的血管化调控。

目前用于研究成骨细胞生物学特性的细胞模型主要包括不同种属来源的原代细胞和永生化或肿瘤细胞系［9］。大鼠成骨细胞由于体外培养容易、纳入标准可控等特点，已被美国食品药品监督管理局批准作为临床前和临床药物疗效评估模型，广泛用于研究激素对细胞表型的影响及评估生物材料的安全性［10－11］。因此，本研究选择大鼠颌骨作为研究对象，采用酶消化法获取颌骨成骨细胞进行实验。

ALP是公认的反映成骨细胞活性的生物标志物，在骨组织钙化过程中发挥重要的作用［12－13］。实验中对所培养的大鼠颌骨细胞进行ALP染色，可见细胞胞质内存在棕黑色颗粒，提示培养的成骨细胞具有ALP活性。此外，mRNA水平检测也发现，细胞经矿化诱导培养后，ALP的表达持续增加。体外矿化能力是成骨细胞的又一重要生物学特征［14］，实验中体外培养的细胞经成骨诱导连续培养后出现局部聚集，形成肉眼可见的矿化结节，茜素红染色呈橘红色。结合ALP检测结果，证实所培养的为颌骨成骨细胞。

RUNX2是成骨细胞的特征性转录因子，作为上游分子可启动成骨分化调控网络中Ⅰ型胶原、OC等下游因子的表达，促进细胞的成骨分化，加速细胞外基质沉积，最终形成骨组织［15］。本研究采用qPCR法对体外培养的大鼠颌骨成骨细胞的RUNX2，Col－Iα1，OC等基因表达进行检测，发现随着培养时间的延长，体外培养的颌骨成骨细胞的RUNX2，Col－Iα1和 OC mRNA 表达水平均显著增高，提示所培养的颌骨成骨细胞具有较好的成骨能力。

VEGF在血管生成和新骨形成中扮演十分重要的角色，通过诱导血管内皮细胞的增殖，增加毛细血管渗透性，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供条件［16］。Angpt－1具有稳定血管内皮细胞的作用，在促进血管分支形成过程中发挥重要作用［17］。FGF－2不仅可促进血管内皮细胞的增殖，还参与调控血管侧支循环的形成［18］。已有报道显示，在成骨分化早期，成血管因子的表达较低，成骨细胞可通过释放成血管相关因子如VEGF等作用于血管内皮细胞上的受体以促进血管化。新生血管不仅可为骨组织的形成输送所需的氧气和营养成分，同时血管内皮细胞还可释放成骨相关因子，如骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）－2 或 BMP－4等，以加速成骨细胞的分化成熟。随着成骨细胞的分化成熟，成血管因子水平逐渐增高，并在成骨分化后期达到高峰，以后逐渐下降至生理水平［4，19］。本研究在检测体外培养颌骨成骨细胞成骨分化能力的同时，采用qPCR及ELISA法分析了大鼠颌骨成骨细胞成血管相关细胞因子 VEGF，Angpt－1和FGF－2的mRNA和蛋白表达水平，结果发现，体外培养的大鼠颌骨成骨细胞在高表达成骨相关基因ALP，RUNX2，Col－Iα1和 OC的同时，还高表达成血管相关细胞因子。本研究结果提示，在骨改建过程中，颌骨成骨细胞不仅参与新骨的矿化成熟，还可通过分泌成血管细胞因子影响新骨的血管化。

尽管研究发现在本实验条件下大鼠颌骨成骨细胞在成骨分化早期成骨相关基因表达增加的同时，其成血管细胞因子在mRNA及蛋白水平均相应显著增高，但上述成血管细胞因子对血管内皮细胞增殖、迁移及血管形成过程的具体作用尚有待后续实验探讨。此外，已有研究发现，疾病状态下如骨质疏松，骨髓基质细胞的成骨分化能力存在异常［20］。考虑到成骨细胞主要来源于骨髓基质细胞，骨质疏松状态下成骨细胞在骨组织形成过程的血管化调控能力的变化也是未来研究的方向。