Exendin－4对t－BHP诱导的SV40细胞氧化应激的影响

陈 粲，王林曦，刘小莺，刘晓红，陈 洲，刘礼斌

糖尿病肾病是终末期肾脏病的主要原因之一［1］，其发病机制与多种因素特别是氧化应激相关［2－3］。肾小球系膜细胞是肾脏的固有细胞之一，其氧化应激增加将导致肾小球硬化加重。胰高血糖素样肽－1（glucagon like peptide－1，GLP－1）是一种由肠道L细胞分泌的肽类激素，分布于多种器官中，而Exendin－4是北美希拉毒蜥唾液中分泌的天然GLP－1类似物。研究表明，肾脏组织中存在GLP－1受体，而Exendin－4可作用于肾脏，减轻氧化应激，从而延缓肾小球硬化的进展［4］。第三丁基过氧化氢（T－butyl hydroperoxide，t－BHP）能分解产生氧自由基，长期被应用于建立细胞氧化应激损伤模型。本实验构建t－BHP诱导下小鼠肾小球系膜细胞氧化应激损伤模型，观察Exendin－4对其影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肾小球系膜细胞（SV40MES 13，中国科学院上海生物研究所）；Exendin－4（批号：＃065M4752）及t－BHP（批号：＃BCBN5378V）（美国Sigma公司）；CCK－8试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）试剂盒、Caspase－3试剂盒（杭州碧云天生物技术研究所）；β－actin一抗（武汉博士德公司）；Bax及Bcl－2多克隆一抗（美国Cell Signaling公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞株生长于含5%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的低糖 DMEM 培养液中（D－葡萄糖浓度5.5mmol／L），置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培育，每2～3天予0.25%胰酶消化传代，待生长至80%～90%融合状态时接种于培养板，培养24h后进行下一步实验。

1.2.2 分组 参考预实验结果，不同浓度（0，25，50，100，200μmol／L）的t－BHP可剂量依赖性引起SV40的存活率降低，当t－BHP浓度＞50μmol／L时，细胞存活率显著低于对照组（P＜0.05），不同浓度（10，25，50，100nmol／L）Exendin－4预处理可改善细胞存活率，并呈剂量依赖性，当Exendin－4浓度＞50nmol／L时，细胞存活率显著高于t－BHP单独处理组（P＜0.05）。根据此结果，最终选择50及100μmol／L的t－BHP 和 50nmol／L 的 Exendin－4进行实验。实验分组：（1）对照组，予含有5%FBS、糖浓度为5.5mmol／L的DMEM 培养液培养。（2）不同浓度t－BHP干预组（T50或T100组），分别予 50 及 100 μmol／L 的 t－BHP 干 预 4h。（3）Exendin－4预 处 理 组 （ET50 及 ET100 组 ），50nmol／L Exendin－4 预处理 2h 后，再予 50 或100μmol／L的t－BHP干预4h。

1.2.3 CCK－8实验检测细胞存活率 将细胞制成5×103mL－1密度的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板中，37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24h，按实验分组分别进行干预，每组设置8个复孔。干预结束后，每孔加入10μL CCK－8溶液，放入培养箱中4h，酶标仪单波450nm波长测定吸光度，计算细胞存活率。

1.2.4 细胞内SOD，GR及Caspase－3活性检测将细胞以5×105mL－1密度接种于6孔板，37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24h，按实验分组分别进行干预，干预结束后收集细胞，检测细胞内SOD，GR及 Caspase－3的活性：（1）SOD，用4℃或冰浴预冷的PBS洗涤2遍，沉淀用预冷的PBS冰浴进行匀浆，匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品，每组设置3个复孔，按试剂盒说明书进行操作，酶标仪单波450nm波长测定光密度，计算细胞内SOD活力。（2）GR，PBS洗涤2次，按每200万个细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min，4℃下16 000r／min离心15min，取上清作为待测样品，每组设置3个复孔，按试剂盒说明书操作，酶标仪单波412nm波长测定光密度，计算细胞内 GR活力。（3）Caspase－3，前期操作步骤同GR检测，按试剂盒说明书操作，酶标仪单波405nm波长测定光密度，计算细胞内Caspase－3活性。

1.2.5 Western－blot检测 Bax及 Bcl－2蛋白表达将细胞以5×105mL－1密度接种于6孔板，37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24h，分为对照组、100μmol／L t－BHP 单 独 处 理 组、Exendin－4＋100μmol／L t－BHP组，干预结束后用细胞裂解缓冲液裂解细胞，4℃下14 000r／min离心15min，取上清液，BCA工作液检测蛋白浓度，并用RIPA将各孔蛋白配平至等体积、等浓度，加入等体积5×上样缓冲液混匀，98℃变性5min。各组取40μg蛋白，在10%SDS－PAGE凝胶中电泳分离，使用半干电转法转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h，孵育相应一抗（1∶1 000）稀释，4℃冰箱过夜，加入相应二抗（1∶2 000），室温摇育1h，ECL化学发光液显色，X射线底片曝光。

2 结 果

2.1 Exendin－4对t－BHP作用下SV40细胞存活率及 SOD，GR，Caspase－3 活性的影响 50 及100μmol／L的t－BHP处理后，细胞存活率分别为（86.99±3.37）%及（72.63±7.92）%，细胞内SOD活性分别为（0.22±0.02）及（0.20±0.02）U／mg prot，细胞 内 GR 活 性 分 别为 （23.75±0.79）及（20.52±0.86）U／mg prot，均较对照组显著降低（P＜0.01）；细 胞 内 Caspase－3 活 性 分 别 为（35.62±0.55）及（40.49±0.98）U／mg prot，较对照组升高（P＜0.01）。使用Exendin－4预处理2h后，各组细胞存活率较t－BHP单独处理组显著升高，ET50组和ET100组细胞存活率分别为（97.63±5.40）%及（93.63±5.54）%，SOD活性分别为（0.33±0.02）及（0.30±0.02）U／mg prot，GR活性分别为（27.77±1.16）及（26.27±1.09）U／mg prot，均较t－BHP单独处理组显著升高（P＜0.05），与对照组比较差别无统计学意义（P＞0.05）。Caspase－3活性分别为（26.56±0.71）及（28.10±1.13）U／mg prot，较t－BHP单独处理组显著降低（P＜0.01），与对照组比较差别无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

2.2 Exendin－4对t－BHP作用下SV40细胞中Bax及Bcl－2蛋白表达水平的影响 t－BHP单独处理组Bax／β－actin比值较对照组上升23.1%（P＜0.01），Bcl－2／β－actin比值较对照组下降31.3%（P＜0.01）。使用 Exendin－4 预 处 理 后，Bax／β－actin比 值 较t－BHP单 独 处 理 组 下 降15.6% （P ＜0.05），Bcl－2／β－actin比值较t－BHP单独处理组上升27.0%（P＜0.01），与 对 照 组 比 较 差 别 无 统 计 学 意 义（P＞0.05）（表1，图2）。

表1 各组Bax及Bcl－2蛋白表达水平Tab 1 Expressions of Bax and Bcl－2among different groups

3 讨 论

图1 Exendin－4对t－BHP作用下SV40细胞存活率及SOD，GR，Caspase－3活性的影响Fig 1 Effect of Exendin－4on viability，SOD activity，glutathione reductase activity and Caspase－3activity in SV40 cells treated with t－BHP

图2 Western－blot检测Exendin－4对t－BHP作用下SV40细胞中Bax及Bcl－2蛋白表达水平的影响Fig 2 Effect of Exendin－4on expression of Bax and Bcl－2protein in SV40cells treated with t－BHP by Western－blot

氧化应激是机体在受到有害刺激时，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），导致机体内抗氧化功能障碍，从而造成组织细胞损伤［5］。病理状态下，线粒体功能障碍，通过蛋白激酶C、多元醇、晚期糖基化终产物等途径引起ROS产生过量［6］，最终导致肾小球硬化。肾小球系膜细胞是肾脏固有细胞之一，对肾脏具有支持和保护作用。研究表明，氧化应激状态下，肾小球系膜细胞中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶被激活，产生大量ROS，诱发细胞凋亡，导致肾脏纤维化［7］。SOD能在肾脏内催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢和氧气，从而清除自由基，GR使机体内的氧化型谷胱甘肽还原为保护性的还原型谷胱甘肽，二者均是机体内重要的抗氧化酶，能间接反映机体的氧化应激水平。肾脏氧化应激增强，同时各种抗氧化酶活性降低，使机体清除自由基的能力减弱，导致肾小球硬化，最终造成慢性肾脏损伤［8］。

Caspase家族是在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶家族，其中Caspase－3是细胞凋亡途径中最为重要的终末剪切酶，在凋亡早期被激活，并参与多种细胞的凋亡。研究表明，ROS可以激活Caspase级联反应导致细胞凋亡［9］，动物实验也证实，由氧化应激引起凋亡的肾脏细胞中Caspase－3表达增加［10－11］，机制可能与细胞色素C介导的线粒体通路以及Fas／FasL通路有关。促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl－2也参与了肾脏细胞凋亡过程。

GLP－1是由肠道L细胞分泌的肠促胰岛素［12］，GLP－1受体分布于机体内胰腺、心脏等多种器官中，GLP－1通过与受体结合发挥对机体的保护作用［13］。研究发现，肾脏中也存在 GLP－1受体，与GLP－1结合后可以抑制肾脏组织中ROS的生成［4］。但由于GLP－1半衰期较短，且在体内易被二肽激肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP－4）分解，在临床上应用有限。Exendin－4是GLP－1受体激动剂，可以通过激活GLP－1受体产生作用，半衰期较长且不被DPP－4降解。国外已有动物实验证明，Exendin－4能降低大鼠肾脏组织中的氧化应激水平，减轻肾小球系膜增生［14］。Park等也证明，Exendin－4能改善肾小球滤过率，抑制肾脏细胞凋亡［15］。

t－BHP是目前被广泛应用的建立体外氧化应激细胞模型的化学物质。本实验中使用t－BHP模拟肾小球系膜细胞氧化应激模型，单独处理4h之后，CCK－8法检测的细胞存活率较对照组降低，细胞内SOD及GR活性降低，Caspase－3活性以及促凋亡基因Bax表达上升，说明t－BHP将诱导系膜细胞内氧化应激，使细胞抗氧化能力下降，进而激活Caspase－3，导致细胞凋亡。给予 Exendin－4预处理2h后，检测细胞存活率及细胞内SOD及GR活性以及抗凋亡基因bcl－2的表达，均较t－BHP单独处理组升高，Caspase－3活性降低。t－BHP单独处理组中，100μmol／L组与50μmol／L组相比，细胞存活率以及抗氧化酶活性均降低，说明t－BHP诱导SV40细胞凋亡可能存在浓度依赖性，有待进一步实验证实。而加用Exendin－4预处理后，2组中的各种指标与对照组比较差别无统计学意义，说明Exendin－4可以提高系膜细胞抗氧化能力至接近正常水平，加强抗氧化作用，抑制Caspase系统激活，降低机体氧化应激水平，从而减少细胞凋亡。因此，Exendin－4可以通过抑制氧化应激，延缓肾脏病变的发生发展，可以作为改善肾脏损伤的药物在临床上推广应用。