唐家河国家级自然保护区中华蜜蜂（Apis cerana cerana）的线粒体遗传多样性分析

李 彪，赖 康，鲜方海，向国栋，周 明，欧阳菠，钟 赟，余姣姣，杨建东*

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川省蜂业管理站，成都 610042；3.青川县唐家河野生资源开发有限责任公司，四川广元 628109；4.平武县林业局，四川绵阳 622550）

中华蜜蜂，简称中蜂，又称东方蜜蜂，主要分布在我国境内的热带、亚热带和温带地区，除新疆之外我国各省、市、自治区中均有分布。杨冠煌等[1]曾考察了东方蜜蜂在我国境内的分布范围，并大致划了4个分布范围和5个亚种。与西方蜜蜂相比，中蜂能有效地利用零星蜜源植物，采集力强且利用率较高。此外，中蜂还具有采蜜期长、适应性和抗螨抗病能力强、消耗饲料少等特点，非常适合中国山区定点饲养，在我国已有3 000多年的驯养历史，是我国极为重要的蜜蜂资源[2-3]。然而近年来，个别饲养者为了获得更好的经济效益，盲目引进外地中蜂或饲养西方蜜蜂，使一些本地中蜂品种严重混杂，失去了特有的地方中蜂性状，给当地的地方中蜂遗传资源带来了损失。盲目地引进外来蜂如同引入外来物种一样，对本土近缘种类会产生干扰竞争，造成不良的生态效应。比如分布区域迅速缩小、野生中蜂数量急减、分布区呈斑块状、传染疾病等[4-6]。鉴于此，各地相关管理部门都对本地中蜂资源进行保护并取得了一系列成绩[7-9]。

线粒体DNA（mtDNA）属于核外遗传物质，具有基因组小、无重组、母性遗传等特点，常被用于分类、系统发育、种群遗传学等研究。同一个蜂群中，蜂王与工蜂拥有同样的mtDNA，一只工蜂的mtDNA就可代表整个蜂群，极大地提高了工作效率，因而mtDNA在蜜蜂的遗传多样性中有大量的研究[10]。近几年，蜜蜂线粒体DNA的分析主要集中在tRNAleu～COⅡ基因的研究[11-13]，如姜玉锁等对中国境内11个不同地理型东方蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ基因多态性进行研究，结果显示中国境内不同地理型东方蜜蜂存在着较明显的遗传分化，其中海南东方蜜蜂由于长期的海岛隔离形成了一个独特的类群[13]。此外，蜜蜂mtDNA其余的基因片段（如COⅠ～COⅡ、tRNAIle～ND2、Cytb 等）也有相关研究[14-16]。

唐家河位于广元市青川县，是四川、甘肃和陕西三省的交汇处，是以大熊猫及其栖息地为主要保护对象的国家级自然保护区。全区森林覆盖率达99.9%以上，保护区内无村民居住、农作物生产和工农业污染，使得这里的蜜源植物丰富且种类繁多，非常适合中蜂产业的发展，创造出唐家河“红石河”蜂蜜等一系列的产品。然而，为了发展中蜂产业，保护区境内的中华蜜蜂近年来面临西蜂和外来中蜂的威胁，部分地区的本地中蜂数量已有下降的趋势，因此有必要采取有效的措施加以保护和利用[17-18]。

本研究基于中华蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ段序列特有的非编码区[19]分析唐家河中蜂的遗传多样性，旨在更好的保护唐家河中蜂资源，为其开发与利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 采样

共采集到唐家河不同海拔高度样本37群，每群采取成年工蜂20只左右，每个采样点随机采1～4群。另外采集绵阳平武、广元苍溪和成都平原的中蜂做比较。样品用100%酒精浸泡，置于-20℃保存。所有样品的采样信息表见表1。

表1 中华蜜蜂不同地理种群采样信息表Table1 Sampling data of different geographical populations of Apis cerana cerana

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取

每群取1～2只工蜂，剪取蜜蜂的胸部肌肉，采用酚-氯仿法对蜜蜂总DNA进行提取[20]。

1.2.2 序列扩增与测序

对中华蜜蜂mtDNA的tRNAleu～COⅡ段进行序列的扩增与测序。PCR扩增引物为通用引物E2:5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3'和H2:5'-CAATATCA TTGATGACC-3'[21]。PCR 扩增体系（20 μL）：2×Easy Tap PCR Super-Mix 为 10 μL、ddH2O为6μL、引物F和R各1μL、DNA 模板为 2 μL。PCR扩增反应程序参数：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，35个循环，72℃ 2min，12℃ 60 min。PCR产物进行正向测序。

1.3 数据分析

DNAStar 7.0对原始序列进行序列的拼接；Mega 6.0进行多重序列比对、输出碱基组成、变异位点、样点间的遗传分化系数等；DNASP 5.0计算平均核苷酸差异数、核苷酸多样度和单倍型多样性等；NJ法构建系统进化树；Network5.0绘制网络中介图等。

2 结果与分析

2.1 序列扩增结果

所有中蜂样本的扩增产物长度均为450 bp左右，包括tRNAleu部分基因序列、COⅡ部分基因序列以及非编码区。

2.2 序列碱基组成及变异情况

测序共获得了45群中华蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ段的部分序列，其中唐家河中蜂样本37群，非编码区长度为88～90 bp。对唐家河样本的非编码区碱基组成分析，结果显示此段非编码区为A+T富集区，A+T含量为86.4%。序列分析结果显示，37个中蜂样本的非编码区共有22个变异位点。22个变异位点大部分为碱基转换，少部分为碱基缺失。其中A/G有6个，T/C有5个，A/T有8个，T/G有1个，碱基缺失有2个。

分析所有中华蜜蜂mtDNA非编码区序列，共发现了18个单倍型，分别命名为TJH1～18。其中唐家河中华蜜蜂分布的单倍型为TJH1～14。将获得的单倍型序列TJH1～14在NCBI上进行Blast比对。结果显示：除 TJH1、TJH3和 TJH6～7外，其余单倍型均有报道（表2）。

各单倍型的序列变异位点见表3。对非编码区进行核苷酸多样度分析，结果显示四川唐家河中蜂的平均核苷酸差异数（K）为2.640，核苷酸多样度（Pi）为 0.030 34，单倍型多样性（Hd）为 0.839。

表2 唐家河中蜂的单倍型在NCBI上对应的登录号Table2 The Apis cerana cerana haplotypes in the NCBI with the Tangjiahe

2.3 单倍型分析

2.3.1 单倍型分布

由表4可知，单倍型TJH1出现在4个样本中，占总样本数的10.81%；单倍型TJH2出现在11个样本中，占总样本数的29.73%；单倍型TJH3出现在2个样本中，占总样本数的5.41%；单倍型TJH4出现在10个样本中，占总样本数的27.03%；其余单倍型的样本数均为1个，分别占总样本数的2.70%。由此可见，单倍型TJH2和TJH4出现的频率最高，为唐家河中蜂的主体单倍型。统计各采样点的单倍型分布发现：鸡公垭、水池坪、太阳坪、阴坝等地的单倍型类型较多且分布均匀，而且同一地点的不同样本其mtDNA序列也存在差异，如鸡公垭的4个样本中共发现3种单倍型，阴坝的4个样本中发现3种单倍型等。此外，4种新的单倍型分别来自蒋家湾、半边街、洪石坝、油库；单倍型TJH4分布最为广泛，蔡家坝保护站周围地区的单倍型最多，遗传多样性也最高。

2.3.2 单倍型聚类分析

以西方蜜蜂为外群（NCBI登录号HQ337457.1），利用NJ法对唐家河地区14个单倍型进行聚类分析。由图1可知，主体单倍型TJH4和TJH3聚类为一支，分布的地点有鸡公垭、蒋家湾、摩天岭入口、阴坝等地；主体单倍型TJH2和TJH12聚类为一支，分布的地点有水池坪、四角湾、松克梁、太阳坪等地；单倍型TJH6和TJH11聚类为一支，分布的地点有油库、大湾河等地。

2.3.3 单倍型网络中介图分析

由图2可以看出，TJH2和TJH4为唐家河2个主体单倍型，其中TJH2和TJH4出现的频率最高，TJH2包含的地区最多，为主要共有单倍型。其中9个单倍型起源于TJH2，TJH6和TJH18与其他单倍型表现出分离。比较唐家河和广元苍溪、绵阳平武的中华蜜蜂单倍型发现，它们之间存在共有单倍型，并没有出现分离；相反，比较唐家河和成都温江的中华蜜蜂单倍型发现，它们之间的单倍型表现出分离。

表3 14个单倍型的序列变异位点Table3 Variation of nucleotide sites of 14 haplotypes

表4 唐家河中华蜜蜂14个单倍型的分布情况Table4 Distributions of 14 haplotypes for honeybees(Apis cerana cerana)in Tangjiahe

3 讨论

本研究中37群中华蜜蜂核苷酸多样度（Pi）为0.030 34，平均核苷酸差异数（K）为2.640，这与徐国威等[15]研究结果相符。该研究利用mtDNA COⅠ～COⅡ分析了四川省中华蜜蜂的遗传多样性，结果显示四川省内的中华蜜蜂具有丰富的遗传多样性，在广元青川地区检测到较多的独有单倍型。谷瑛等[12，22]利用相同基因序列分析了重庆地区中蜂的遗传多样性，得到核苷酸多样度（Pi）分别为0.017 92和0.018 19，说明唐家河中蜂的平均核苷酸多样度高于重庆地区。与国内其余地方，如浙江、福建、海南和吉林长白山等地[11，23-25]比较，唐家河地区的核苷酸多样度或平均核苷酸差异数也相对较高，这可能与唐家河位于甘肃、陕西和四川三省交界这一特殊的地理环境有关。

图1 基于NJ法的各个单倍型聚类分析Figure1 Cluster analysis of haplotypes based on neighbor-joining（NJ）method

唐家河地区中峰丰富的单倍型说明该区域具有丰富种质遗传资源，拥有很大的保种价值。根据mtDNA非编码区序列和聚类分析结果可以看出，唐家河地区单倍型的划分与其气候、植物和特殊的地理环境等因素有很大关系，促进了保护区内中蜂的分化。单倍型TJH7来源于距离较远的洪石坝，其余采样点都未出现，推测可能与洪石坝的地理位置较远、海拔较高、人为干扰较少等因素有关。此外，唐家河不同地方中蜂mtDNA的遗传结构差异不大，且与周边地区（绵阳平武和广元苍溪等）的中华蜜蜂也相似。由此可见，地理环境造成的差异并不是引起唐家河中华蜜蜂遗传多样性的决定因素，唐家河中华蜜蜂遗传结构差异不明显。根据单倍型网络中介图可以看出，绵阳平武、广元苍溪都有与唐家河相同的单倍型，可能是因为平武和苍溪距离唐家河地理位置较近，但也不排除近年来当地引进外来蜂造成的原因。由于蜜蜂特殊的繁殖方式，外来蜂一旦适应了本地的气候，很容易与本地蜂产生基因交流，破坏种质遗传资源。因此，在大力发展养蜂产业的同时，也要严格控制外来引进蜂的数量，保护唐家河当地蜂种的遗传多样性。

图2 唐家河地区中华蜜蜂非编码区单倍型网络中介图Figure2 The median-joining networks of Tangjiahe Apis cerana cerana populations based on non-coding region of mitochondrial tRNAleu～COⅡ fragment