一个新的薄皮甜瓜叶色突变体的生理特性及超微结构分析

赖 艳，付秋实，吕建春，周梦迪，何 茂，许炜萍，王怀松，黄 志*

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.农业部园艺作物生物学与种质创制综合性重点实验室，北京 100081）

甜瓜（Cucumis melo L.），葫芦科甜瓜属作物，具有多种变异类型，其中叶色变异是最为常见的变异之一。在自然或人工诱变的条件下，叶绿素的合成与降解途径异常、叶绿体结构受到影响均可导致叶色突变体的产生[1-2]。叶色突变体是植物光合系统、抗病机制及激素生理等代谢过程的重要研究材料，同时也是分析鉴定基因功能和创造优异种质资源的理想材料[3-6]。目前，关于叶色突变体的生理特性研究方面已有相关报道，但不同的突变体研究结果不尽相同。相对于大田作物而言，葫芦科作物变异类型较少，突变机理仍不明确。

本试验以薄皮甜瓜自然黄化转绿突变体 MT、非突变体亲本WT及F1（MT×WT），rF1（WT×MT）为研究材料，调查各处理不同时期的主要农艺性状，测定其光合指标、光合色素含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）及丙二醛（MDA）含量等并进行比较分析，初步探讨了该突变体与非突变体亲本及其子代的生理生化差异，分析了其突变机理，丰富了葫芦科植物光合作用机制的理论基础，为后续研究突变基因精细定位与挖掘提供重要参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供，正常叶色甜瓜WT为薄皮甜瓜材料。叶色黄化转绿突变体MT是从甜瓜高代自交系WT田间栽培中发现的一个自然黄化转绿突变体（图1），叶色黄化性状能够稳定遗传。

MT、WT、F1（MT×WT），rF1（WT×MT）于2016年3月—7月种植在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验农场塑料大棚内，吊蔓种植，常规田间管理。

图1 黄化转绿突变体的表型性状Figure1 Phenotypes of MT and WT

1.2 农艺性状调查

测量WT、MT以及F1、rF1的各个时期的主要形态指标（子叶期、幼苗期、开花期、结果期），用刻度尺测量株高、叶面积（叶片长×叶片宽）；用游标卡尺测量茎粗；用便携式叶绿素仪SPAD-502测定SPAD值，开花期和结果期选取植株正常发育的功能叶片。

1.3 果实性状测定

从果实授粉当天直到果实成熟采摘时，每隔7 d用游标卡尺对果实纵横径进行一次测定，并计算果形指数。

1.4 光合特性及抗氧化酶活性的测定

1.4.1 光合参数的测定

在成株期用 LI-6400XT便携式光合仪于晴天上午9:00—11:00分别对 WT、MT完全展开的功能叶片测定净光合速率（Pn）、气孔导度（GS）、蒸腾速率（Tr），胞间 CO2浓度（Ci）进行测定[7]。

1.4.2 光合色素含量测定

随机选取WT、MT以及 F1、rF1子叶期，幼苗期（4叶期），开花期（植株顶部向下数第5片叶）、结果期（植株顶部向下数第 5片叶）的新鲜叶片，采用UV1102型紫外可见分光光度计进行光合色素测定，含量以 mg/g（鲜叶）表示[8]。

1.4.3 酶活性以及丙二醛（MDA）含量的测定

分别在幼苗期、开花期、结果期，取 WT、MT以及F1、rF1相同功能部位的叶片测定抗氧化酶活性。其中采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈创木酚法采用过氧化物酶（POD）活性；采用紫外分光光度法测定过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）[8]。

1.5 叶绿体超微结构观察

在幼苗期，选取WT和MT植株中完全展开的功能叶，在叶片中部主脉两侧切取大小1～2 mm见方小块，用4%戊二醛前固定，pH7.2磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸后固定，梯度乙醇逐级脱水，环氧树脂812渗透并包埋，利用ULPRACUT-E型超薄切片机切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，H-7650型透射电镜观察叶绿体超微结构、形态和分布,测量大小并拍照[9]。

1.6 数据分析

使用 Excel2010、SPSS 19.0对数据进行处理并用Duncan新复极差法进行方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同时期甜瓜MT与WT及其子代的形态特征差异

由表1可知，在植株生长发育整个阶段中，WT与MT及其F1、rF1的主要形态指标差异较为明显。其中，从幼苗期到结果期，株高、茎粗、叶面积、SPAD值都出现升高趋势；在结果期，与WT相比，MT的株高、茎粗、叶面积、SPAD值分别降低9.45%、3.03%、7.75%、6.44%。株高、茎粗在幼苗期差异不显著，叶面积、SPAD值基本上在全生育期中均达到显著差异。F1、rF1的茎粗与WT差异不显著，而株高、叶面积在全生育期中都高于WT；在结果期，F1、rF1的株高分别提高了15.55%、5.86%，叶面积分别提高了41.67%、13.24%，而SPAD值没有一致的变化规律，除开花期低于WT外，其他生育期均高于WT。

表1 不同时期甜瓜MT与WT及其子代的形态特征差异Table1 The morphological differences in MT，WT and F1during different stages

2.2 果实外观特性分析

由表2可知，从授粉当天到果实成熟，各个处理植株的果实纵径和横径均逐渐增大，而果形指数则降低。与果实授粉当天相比，果实成熟时的果形指数分别下降了33.70%、35.42%、28.66%、30.29%，从而使得果实生长趋于长圆形变化。在果实采摘时，与WT相比，MT橫的果实纵径、 径分别降低了3.22%、0.99%，而果形指数则降低了0.22%；F1的果实纵径、橫径分别提高了26.52%、13.43%，其果形指数提高了11.57%；rF1分别提高了26.16%、13.43%，其果形指数提高了11.23%。

2.3 MT植株子叶及第1真叶叶绿素含量的变化分析

前期调查发现，MT的子叶为黄色，WT为绿色，随着苗龄的延长，突变体子叶颜色开始转绿。由表3可知，MT第1真叶的叶绿素含量与WT的变化有所差异，MT中的叶绿素含量先上升后下降，而WT中的则是逐渐下降，但整个测定周期中，MT中叶绿素含量始终低于WT。其中，在各个时期MT第1真叶的叶绿素含量较WT的分别降低了38.98%、23.25%、6.15%、13.15%。在MT第1真叶完全展平时，植株黄化性状较WT区别尤为明显，WT植株为绿色，MT植株为金黄色，但叶脉为绿色。

2.4 不同时期甜瓜MT与WT及其子代光合色素含量的变化分析

如图 2 所示，WT、MT、F1、rF1的光合色素含量在整个生育期中都出现升高趋势。与WT相比，MT的叶绿素及类胡萝卜素含量在结果期分别降低25.69%、21.26%；MT的叶绿素a与叶绿素b的比值在开花期达到最大值，提高了1.88%；而MT的类胡萝卜素与叶绿素的比值先升高后降低，且在幼苗期达到最大值，提高了2.44%。在结果期，与WT相比，F1、rF1的叶绿素含量分别降低了19.01%、8.16%；类胡萝卜素含量分别降低了17.30%、2.58%。

表2 不同时期甜瓜MT与WT及F1代果实大小的变化趋势Table2 The change trend of MT，WT and F1in different stages

表3 MT与WT子叶及第1真叶叶绿素含量的变化Table3 The chlorophyll content in cotyledon and first true leaf of MT and WT

图2 不同时期甜瓜MT与WT及F1代光合色素含量的变化Figure2 Photosynthetic pigment content change of MT,WT and F1in different stages

2.5 成株期MT与WT的光合特性差异

由表4可知，MT与WT的光合作用在成株期时存在差异，MT植株的气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率差异显著，较WT分别提高了47.95%、12.80%、31.87%，但净光合速率差异不显著。

2.6 不同时期甜瓜MT与WT及其子代抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量分析

由图3可以看出，WT、MT以及F1、rF1在整个生长阶段中的抗氧化酶活性及丙二醛含量差异较为明显且变化规律不一致。SOD酶活性在整个生长阶段中出现先升高后下降的趋势，POD酶活性则一直处于升高的趋势，而CAT酶活性则是一直下降的趋势。在结果期，与WT相比，SOD酶活性达到显著差异，且SOD、POD、CAT酶活性分别提高了65.45%、13.91%、3.23%。F1、rF1的酶活性含量与 WT差异不显著，F1分别提高了 1.47%、13.88%、4.09%，rF1分别提高了2.05%、14.88%、1.88%。MDA含量从子叶期到结果期出现升高的趋势。在结果期，与WT相比，MT的MDA含量提高了15.14%，而F1、rF1的MDA含量与WT差异不显著，分别降低了1.29%、2.45%。

表4 成株期MT与WT的光合特性差异Table4 Photosynthetic characteristics difference of MT and WT in adult stage

图3 不同时期甜瓜MT与WT及其子代SOD、POD、CAT活性及MDA含量的变化Figure3 The changes of Superoxide dismutase,peroxidase,catalase activity and malondialdehyde content of MT，WT and F1in different stages

2.7 甜瓜MT与WT幼苗期叶绿体超微结构观察

由表5、图4可知，甜瓜MT与WT幼苗期叶绿体结构存在着显著差异。MT的叶绿体结构较WT简单，叶绿体发育不完整。其表现为叶绿体轮廓不清，无明显的膜结构，淀粉粒少，基粒排列不整齐，形状呈不规则的线条状，基粒片层堆叠数少，间距大，排列疏松，内含物混浊，透明度较差，嗜锇体较少。而WT叶绿体发育正常，基粒片层有规律的紧密排列，结构发育正常，淀粉粒较多，膜结构清晰可见。与WT相比，MT的叶绿体数、淀粉粒数较少，光合产物积累较少；其中MT的叶绿体细胞减少了37.50%，淀粉粒细胞减少了55.55%。

3 讨论与结论

近年来，叶色突变体已在多种植物中被发现并进行了研究，其关注度也越来越高。由于叶色突变体自然突变发生频率较低，因此对甜瓜叶色突变体的研究相对较少。本试验中，MT的黄化性状在一叶期时，叶色区别尤为明显，随着植株的生长发育，叶片颜色逐渐转变为黄绿色，每一片新生的叶片表现黄化，但叶脉仍为绿色，后期由叶尖向基部逐渐转绿。这与李音音等[10]报道的甜瓜MT在整个生育期内都呈现黄化有所差异，与国艳梅等[11]报道的出现早衰现象的MT也有所区别，是一个新的甜瓜叶色黄化突变体。

叶色变异的发生机制较为复杂，其与叶绿体发育、光合色素含量有着直接的关系[12]。本试验中不同时期MT的叶色SPAD值、总叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量都显著低于WT，这是叶片表现出黄化性状的重要原因。这与邵勤等[13]、李音音等[10]、王聪田等[14]的研究的结果一致。叶绿素和类胡萝卜素含量减少，叶绿素a/b的值增大，说明叶绿素b的降低幅度大于叶绿素a，推测叶色黄化突变体可能是叶绿素b缺失类型，突变引起叶绿素a向叶绿素b的转化，使得叶绿素b的降低幅度大于叶绿素a。这与茹广欣等[15]在泡桐的叶色研究结果基本一致。类胡萝卜素与叶绿素的比值先上升后下降，与MT有黄转黄绿的趋势一致，但胡萝卜素差异变化是否决定叶片黄化还有待进一步研究。

表5 MT与WT叶绿体超微结构比较Table5 The difference of chloroplast ultrastructure between MT and WT

图4 MT与WT叶绿体超微结构比较Figure4 Comparison of chloroplast ultrastructure between MT and WT

本试验中MT的光合效率在成株期时与WT无显著差异，叶绿素含量与净光合效率没有相关性，这与林钰琼等在水稻的研究结果相似[16]。虽然MT的叶绿素与类胡萝卜素的含量均低于WT，但类胡萝卜素与叶绿素的比值却高于WT，说明类胡萝卜素有可能作为辅助捕光色素，扩大吸收光的范围，从而提高光合效率，这与曹莉等对小麦的研究结果一致[17]。同时，MT与WT苗期的叶绿体结构也存在显著差异。MT的叶绿体结构较WT简单，其叶绿体轮廓模糊，内含物混浊、淀粉粒少，基粒片层垛叠数较少，此结果与涂政军等[18]、肖华贵等[19]的研究结果一致。从叶绿体结构差异上分析，叶绿素存在于类囊体膜上，由于叶绿体发育异常，使得叶绿体数目和基粒片层数少，导致MT的叶绿素含量下降，表现出黄化性状。

叶色突变体可激活植株体内的抗氧化酶系统，避免叶绿体受到活性氧的损害，防止膜脂过氧化加剧，提高突变体的抗逆性[7，20]。本试验中，MT的抗氧化酶活性、MDA含量显著高于WT，可能是由于MT激活了机体内自身的保护酶系统，减少了叶色突变带来生理层面的不良影响，缓解细胞受损伤的程度，提高抗逆性，从而维持植株的正常生长。但是MT的结构异常使得其一直处于逆境生长中，MDA不断积累，使得MT植株在整个生长期长势较弱，并在生后期出现一定的早衰现象。而F1、rF1的酶活性与WT差异不明显，说明杂交后代已不具备MT的独有特征。通过MT与WT构建的遗传群体发现F1、rF1都表现正常的叶色（绿色），推断MT属于细胞核基因控制的隐性突变[21-24]。

综上所述，本试验从生理水平与叶绿体结构上初步探究了叶色突变的机理，推测本试验材料叶片黄化的主要原因是叶绿体结构发育不完善引起的叶绿素含量的降低，为细胞核基因控制的隐性突变。但黄化突变机制极为复杂，其分子机理有待进一步研究。继续挖掘影响叶色变黄的因素对于甜瓜新品种的培育极为重要，同时也为今后开展对突变体的基因定位及克隆等研究工作奠定基础。