芝麻香微生物的研究与应用

张聪芝，陆其刚，陈 力，张龙云，胡风光，陈孚江，蒲 春，刘 亮

(江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800)

芝麻香型白酒是建国以来创新形成的香型之一，周恒刚、沈怡方等老前辈对芝麻香生产技术及生产工艺进行了总结，即生产原料的高氮配比、汲取酱香型白酒的高温堆积、高温入窖工艺，并开创了麸曲纯菌种微生物生产芝麻香酒的模式，同时推动了芝麻香曲及酿酒生产的机械化、自动化。江苏洋河酒厂股份有限公司在前期研究的基础上创新性地总结研究芝麻香微生物，形成了集微生物代谢、机械化制曲、机械化酿酒等芝麻香系统体系[1-2]。

1 洋河芝麻香特性微生物代谢研究

洋河酿酒微生物技术研发团队经过多年潜心研究，从生理特性、多酶代谢、风味代谢等方面对芝麻香微生物代谢机理进行了研究，确立了洋河芝麻香复合微生物、复合酶系以及特性风味化合物方面形成的特有风格[1-3]。

1.1 芝麻香微生物生理特性研究

1.1.1 微生物分类地位

通过显微特性、菌落特性以及生化鉴定，初步形成了芝麻香微生物的显微形态、菌落形态、基础生化等基础特征：如酵母呈乳白色中间凸起菌落、产膜、发酵较强、芽生率较高分裂快；芽孢杆菌特有的芽孢、菌落圆形及不规则、可产色素；霉菌在淀粉培养中有明显的透明圈，分生孢子梗长短不一等特性。同时委托中国食品发酵研究院运用分子生物学技术进行鉴定，确认白曲为半知菌亚门真菌属河内白曲，酵母为汉逊酵母（Hansenula anomala）、酒香酵母（Saccharomyces cerevisiae）、德克酵母（Dekkera）等；细菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等；多种类芝麻香微生物丰富了正在筹建的优质洋河酒酿造微生物菌种库。微生物显微及菌落形态图见图1。

图1 微生物显微及菌落形态图

1.1.2 特性生长规律（图2）

图2 芝麻香微生物（生香酵母）菌体生长曲线

经过定向选育的3类芝麻香微生物无论是细菌分裂、酵母芽殖等都具有繁殖迅速的特点，细菌与酵母一般经过2～3 h的延滞期迅速进入对数期，8～10 h进入稳定期，进入产酶及风味代谢阶段，白曲在大盘培养到12～16 h时，菌丝生长迅速密布盘面进入淀粉酶、蛋白酶旺盛期，持续旺盛期至32 h左右进入生长后期（表1）。

表1 菌体浓度统计表 (×109个/g)

3类芝麻香微生物在种子培养阶段及机械化圆盘培养阶段繁殖迅速，逐渐形成优势数量的微生物类群，这是高效代谢相关酶系，代谢典型化合物，形成洋河芝麻香典型风格的基础；经近期研究统计发现单品酵母曲酵母数量达到109个/g以上，细菌达到109个/g，白曲孢子含量达到1010个/g。

1.2 芝麻香微生物代谢特性研究

1.2.1 特性多酶代谢

通过研究[2-3]发现，河内白曲、芽孢杆菌、汉逊酵母每种微生物具有特定的产酶特性，河内白曲以高产淀粉酶、酸性蛋白酶为主；芽孢杆菌兼具中性酸性蛋白酶活力（表2），高蛋白酶活力是分解含氮物质形成美拉德反应前驱物的基础，也是形成细菌曲及芝麻香曲典型风味的前提；酵母则以高效的发酵产酒、生香为主，高发酵力对于后期堆积升温、霉层生长有利。

洋河选育的芝麻香微生物既具有芝麻香曲行业中微生物的共性，又有典型个性，不同活性和不同酶类的特性组合形成了洋河特有风格体系。

1.2.2 特性风味代谢

江苏洋河酒厂股份有限公司依托风味物质研究室深入研究了芝麻香微生物代谢的特征风味，通过纯种条件下固态液态培养，运用气相色谱（GC）及气质联用（GC-MS）分析，确立了不同菌株风味代谢共性及特性，明确了醋酉翁、3-甲硫基丙醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇、四甲基吡嗪、呋喃类、愈创木酚等典型风味化合物定性、定量代谢特征（表3）。

酵母以发酵为主兼顾产香，其中4#菌愈创木酚单株最高产量达到98.43×10-10g/g，5#菌单株β-苯乙醇产量达到24.67×10-10g/g（如表3）；嗜热芽孢杆菌以产吡嗪类、多酚类、吡啶等杂环类化合物为主，江南大学最新研究发现的四甲基吡嗪由微生物代谢产生[5]，其中139#细菌四甲基吡嗪单株最高产量达到23.45×10-10g/g（表4），基于此为典型菌株的强化应用提供了依据，为多组合混合发酵、多种类不同配比芝麻香曲生产奠定了基础。洋河芝麻香微生物风味代谢特性是构成洋河芝麻香风格特性的基础。

表2 芝麻香成品曲综合酶活力表

表3 酵母特性化合物定量分析表

1.3 芝麻香微生物多菌种混合发酵研究

传统白酒生产为多菌种混合发酵模式，白酒微生物的研究是从混合到分离纯化研究到混合发酵研究应用（混合-分离-混合），是传统发酵的未知到纯种分离后的明确再到纯种混合的深入，正是这种模式引领白酒酿造从未知到已知促进科研的进步。江苏洋河酒厂股份有限公司本着依托生产、专注科研、服务生产的原则从三角瓶细菌混合发酵研究、发酵罐酵母混合发酵研究到配方组合混合发酵研究取得了一系列成果。

1.3.1 酵母混合发酵研究

基于酵母固液态纯种发酵的研究为充分发掘酵母高发酵力及产香能力，对发酵罐混合发酵进行跟踪测定，综合分析糖消耗，发酵产酸，菌体浓度情况（图3）；同时利用配方组合设计进行固态模拟混合发酵，经验证确定了酵母优势产香性能组合。

随着菌体生长发酵酸度逐步积累，菌体浓度在16 h以前，按延滞期—对数期—稳定期生长，16 h达到波峰，菌体浓度降低后，28 h左右再次达到波峰，发酵液糖浓度也出现相应的波动，确定了混合发酵过程菌体生产代谢的规律。

同时，经过10种配方组合条件下模拟固态发酵实验，分析代谢风味物质情况结合发酵力、酯化率指标确定了一种优化组合4（表5），此种比例下代谢4-乙烯基愈创木酚含量达到9.95×10-10g/g，β-苯乙醇低于纯培养的产量。鉴于发酵罐混合发酵生产情况以及模拟配方组合混合发酵的数据，为酵母曲圆盘工艺的探索奠定了理论基础。

1.3.2 细菌混合发酵研究

河内白曲以分解淀粉为主，功能酵母以发酵产酒为主，功能细菌即芽孢杆菌以代谢四甲基吡嗪、4-乙烯基愈创木酚等典型化合物，依托纯种发酵典型化合物的定性定量分析，采用配方组合设计模拟固态发酵，研究最佳混合发酵模式，对比分析结果发现，实验模拟组合8四甲基吡嗪同比其他组合产量最高，按照8#组合进行5株菌重复发酵验证，经过测定分析，四甲基吡嗪含量达到130.85×10-10g/g，远高于单株菌最高产量，4-乙烯基愈创木酚达到68.94×10-10g/g（表6），远高于酵母产量，进一步验证了细菌代谢是产生芝麻香典型风味的主体[6-7]。

表4 细菌特性化合物定量分析表 (×10-10g/g)

图3 酵母液态混合发酵菌体生长代谢综合分析图

表5 酵母混合发酵模拟组合指标分析表

表6 细菌混合发酵模拟组合指标分析表 (×10-10g/g)

2 机械化圆盘制曲工艺研究

2.1 CM-7机械化圆盘中试工艺探索

2.1.1 培养条件研究

对芝麻香微生物的培养基及部分培养条件进行了大量的科研实验，从斜面菌株到三角瓶培养，从发酵罐增殖到圆盘培养进行了逐级优化，确定了培养基组成及培养条件。

(1)选取大米、玉米粉、麸皮3种不同培养基研究河内白曲糖化力和蛋白酶活力情况：即麸皮为基质时糖化力最高，玉米粉为基质时蛋白酶活力较高，这与芝麻香曲行业研究具有一致性，同时对比了不同水分含量、不同pH值对白曲代谢产酶的影响，实验室条件下70%～80%含水量、pH4.5～5.0时，糖化力和蛋白酶活力维持在较高水平（表7）。

表7 不同培养基质酶活力分析表

(2)对比饴糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等培养基，在发酵罐中的酵母增殖趋势，发现多碳源时辅以一定有机氮源增殖较快（图4），最终确定了葡萄糖、饴糖及蛋白胨最佳配比，酵母菌数量在24 h稳定在108个/mL左右。

(3)对比入盘细菌曲数量、pH值、稻壳用量、外加氮源量等条件，经过反复的探索确定了最佳条件，使嗜热芽孢杆菌的增殖及风味代谢处于最佳水平（图5），尤其典型风味物质的代谢，增强了芝麻香曲风格的典型性。

图4 不同基质混合培养条件下酵母菌生长趋势图

图5 不同条件下芽孢杆菌增殖趋势图

2.1.2 中试扩培研究

基于前期研究利用CM-7机械化圆盘进行中试，探索制曲培养过程参数，提高芝麻香微生物代谢性能，促进曲质质量提升；从入盘温度、品温控制、通风量、通风强度翻曲时间、翻曲次数等多方面探索白曲、细菌曲、酵母曲最佳培养条件，确定了最优中试培养工艺。

即白曲、酵母曲最佳培养温度为30～35℃；细菌曲前期以通风增殖为主，后期以静培养酶增香为主；白曲前期增加翻曲以促进菌体萌发增殖、细菌后期以少翻、不翻为主，促进嗜热芽孢杆菌代谢产生典型风味物质；持续跟踪酵母生产周期内菌体增殖、发酵力、酸度等指标的综合变化（图6），展现出一个发酵周期内菌体增殖、产酸及底物消耗等参数的波动变化。

2.1.3 多微复配试验探索

对不同微生物属内及属间配方组合研究，如嗜热芽孢杆菌代谢四甲基吡嗪最优组合A（如表6）优化后四甲基吡嗪产量达到130.85×10-10g/g；基于此进行属间复配比例探索，确定最佳组合，使芝麻香微生物增殖特性、产酶特性、代谢性能发挥到最大。

不同比例复配曲风味代谢分析见表8，结果表明增加细菌曲比例可显著增加芝麻香曲典型风味化合物的代谢，增加嗜热芽孢杆菌的种类可提高四甲基吡嗪的代谢总量。

2.2 CM-13机械化圆盘制曲工艺研究

基于前期芝麻香微生物代谢特性、混合发酵模型分析以及制曲中试生产的成功探索，江苏洋河酒厂股份有限公司进一步引进CM-13机械化自动培养圆盘，实现了芝麻香机械化、现代化、高效率生产，为高档芝麻香酒的生产奠定了基础；将现代生物工程技术与白酒生产工艺结合，充分发挥了芝麻香微生物的作用，实现了科研成果的应用与产业化转化。

图6 CM-7自动控温圆盘酵母曲增殖趋势图

表8 多微复配曲典型风味化合物比对表 (×10-10g/g)

2.2.1 原料蒸煮灭菌（图7）

图7 原辅料投料蒸煮工艺流程图

芝麻香曲是以麸皮为主要原料经过人工培养形成的麸曲，前期研究及行业总结发现麸皮是制作芝麻香曲的良好培养基，添加稻壳及有机氮源、营养盐经过高温、高压旋转蒸煮，完成灭菌及原辅料的熟化，达到芝麻香微生物最佳的利用和繁殖条件。

表9 原料配比及蒸煮标准

蒸煮即是原料的混合、润料、灭菌过程，又是淀粉液化、糊化过程，经过反复的实验探索确定了芝麻香单品曲原料的配比及蒸煮条件（表9），即添加5%～10%的稻壳作为疏松剂，控制40%～60%的水分含量，0.15～0.22 MPa蒸煮15～30 min，保证了原辅料充分混合均匀，杀灭杂菌，淀粉、蛋白质底物充分分解，物料熟而不黏，利于微生物的生长繁殖。

2.2.2 制曲过程控制

蒸煮结束物料采用风冷的模式将物料降温，风送至培养CM-13机械化自动化控温圆盘，采用边入盘边接种确保接种均匀，通过前期中试探索和生产实验洋河已经总结出一整套固态、液态菌种扩培模式，保证了白曲种子、细菌酵母种子较高的繁殖性能。制曲工艺见图8，平面图见图9。

图8 圆盘制曲工艺流程图

图9 圆盘制曲过程工艺平面图

入盘后翻曲均匀可调取、白曲、细菌、酵母培养参数开启通风、控温、控湿自动培养；根据不同培养阶段生长状态，经过中试探索、扩大培养多批次优化，最终确定了最优的培养参数，即初级阶段低频率高风温，旺盛阶段高频率低风温的控温培养模式，以及高频率低风温的快速低温烘干模式，有力保证制曲温度在最佳范围，低温烘干减小酶活力和菌体数量最小损失。温度变化见图10。

图10 起始入盘至控温培养温度变化图

2.2.3 多微配方复配

芝麻香单品曲即河内白曲、细菌曲、酵母曲，根据不同生产需求及前期研究，按照不同复配比例进行多微复配（图11），发挥芝麻香微生物最大优势，增加目的代谢产物，促进芝麻香典型风格的形成。

图11 多微复配工艺流程

经过反复的实验论证，按比例复配后成品芝麻香曲糖化力、蛋白酶活力、发酵力各项指标均达到芝麻香曲质量标准要求，经过中试车间试用芝麻香曲发酵效果良好，堆积升温良好、酶层适中、堆积醅香气浓郁，入池发酵状态良好，目前在江苏洋河酒厂股份有限公司全面推广使用，为优质芝麻香酒的生产奠定了基础[8-10]。

3 结论与展望

本文系统总结了近年来江苏洋河酒厂股份有限公司在芝麻香曲科研及机械化生产方面的研究进展；阐述了芝麻香微生物生长及代谢特性，即多种类多数量芝麻香微生物的增殖、多酶代谢、典型风味特征代谢；以及多菌种混合发酵过程中菌体协同、代谢互补等菌体生长及风味代谢规律；通过优化CM-7机械化圆盘中试生产工艺，依托中试探索成功总结确定CM-13机械化圆盘原料蒸煮、过程培养等关键性制曲工艺，保证了优质芝麻香曲的高效供给，为芝麻香酒的酿造及公司在芝麻香产业的发展奠定了坚实的基础。