AMPK磷酸化在异烟肼致肝损伤中的作用

刘瑞雪，鲁桓兵，宋育林

结核病目前仍然是全球灾难性疾病之一，在结核病临床防治过程中，异烟肼(isoniazid，INH)是一线抗结核药；异烟肼的使用会产生不良反应，主要是抗结核药物性肝损伤(antituberculosis drug-induced liver injury，ADLI)，严重者可使治疗中断或失败，甚至造成肝衰竭或死亡[1]。异烟肼所致肝损伤涉及多种机制，可能与代谢产物的直接毒性作用、基因多态性、氧化应激反应、线粒体功能障碍、免疫反应、肝细胞转运体异常等因素相关[2]，确切机制目前仍不明确。AMP依赖的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]参与多种机制调节，在脂质代谢上，AMPK通过调节自身磷酸化参与脂质合成和分解代谢，磷酸化AMPK通过修饰乙酰辅酶羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)磷酸化而抑制酶的活性，抑制脂肪酸合成，减少脂质积累[3]。Foretz et al[4]研究证明AMPK磷酸化可抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)，引起脂肪酸合成减少。异烟肼所致肝损伤的病理表现有脂肪变性，炎细胞浸润等。该研究通过建立异烟肼所致肝损伤大鼠模型，探讨AMPK磷酸化在异烟肼所致肝损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 健康SD大鼠，SPF级，雄性，体质量120～150 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.1.2药品与试剂 异烟肼购自美国Sigma公司；生理盐水购自中国大冢制药公司；总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肝组织TG试剂盒购自北京普利来公司；AMPK、p-AMPK、p-ACC一抗购自美国Cell Signaling公司；FAS、GAPDH一抗、辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.1.3主要仪器 DPP全自动生化分析仪(瑞士RocheModular公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2实验方法

1.2.1分组 按照随机数字表法将24只大鼠随机分为3组:正常对照组、异烟肼低剂量组、异烟肼高剂量组，每组8只。所有大鼠进行标准化饲养，自由进食，饲养环境温度 (20±2)℃，室内湿度保持在 50%～70 %，昼夜节律保持 12 h 光照与 12 h 黑暗交替。每3 d称重一次，适应性饲养1周。

1.2.2给药 参考文献[5]方法及本课题组前期实验基础，异烟肼组给予 50 mg/(kg·d)异烟肼及100 mg/(kg·d)，正常对照组给予等剂量生理盐水，均每日定时灌胃一次，共2周。

1.2.3取材 给药2周后处死大鼠。取材前禁食、水12 h， 水合氯醛300 mg/kg麻醉后腹主动脉采血，收集血清，留取肝左叶，用10%福尔马林缓冲液固定，余肝脏组织冻存于液氮中，随后转移至-80 ℃冰箱储存待测。

1.3观测指标及测定方法

1.3.1肝指数测定及形态学观察 称重后处死大鼠，低温下完整迅速取肝，称重，计算肝指数(肝指数=肝重/体重)，取部分肝左叶组织，10%中性福尔马林组织液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片及HE染色。光学显微镜下观察肝组织形态学结构。

1.3.2血清肝功能指标 全自动生化分析仪测定大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)总胆红素(total bilirubin，TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及总胆汁酸(total bile acid，TBA)水平。

1.3.3血清血脂指标 使用试剂盒于酶标仪测定大鼠血清TG、TC水平。

1.3.4肝组织血脂指标 使用试剂盒于酶标仪测定大鼠肝脏组织TG水平。

1.3.5肝脏组织p-ACC免疫组织化学染色 按照VP-6001二步法免疫组织化学试剂说明书进行，一抗浓度为1 ∶400，用PBS代替一抗作为阴性参照，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。阳性结果判定标准：肝细胞的胞质内出现棕黄色为阳性细胞，每例在光镜下随机挑选5个高倍视野(×400)，每个视野取5个视场，每个视场面积为268 μm2，采用Image plus 6.0高清晰图像分析系统进行分析切片，测定肝组织p-ACC染色的平均光密度(optical density，OD)值。

1.3.6Western blot测定 AMPK、p-AMPK、FAS蛋白表达 提取大鼠肝蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加AMPK及p-AMPK(1 ∶1 000)、FAS(1∶100)、DAPDH(1∶200)一抗，于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，相应的二抗(1∶5 000)室温孵育，TBST洗膜，化学发光法检测荧光信号。采用Image J高清晰图像分析系统进行分析，测定肝组织p-AMPK、AMPK、FAS、GAPDH表达的灰度值。

2 结果

2.1一般情况与正常对照组比较，异烟肼组大鼠毛发光泽减弱，尤以高剂量组明显，活动度一般，体重增长幅度较小。与正常对照组比较，异烟肼组在进入实验第6天体重增加幅度下降。异烟肼组大鼠在实验第6天(F=4.259，P<0.05)、第9天(F=4.782，P<0.05)、第12天(F=4.882，P<0.05)及实验结束时(F=6.281，P<0.001)低于正常对照组。见图1。

图1 各组大鼠体重增长曲线

2.2肝指数异烟肼低剂量组、异烟肼高剂量组大鼠肝指数分别为(0.032±0.002)和(0.037±0.001)，均较正常对照组肝指数(0.031±0.001)增加，且异烟肼高剂量组与正常对照组相比差异有统计学意义(F=34.444，P<0.01)。

2.3血清肝生化变化异烟肼高剂量组ALT、AST分别较正常对照组显著增加(P<0.01)。异烟肼高剂量组血清TG较正常对照组显著增加(P<0.05)。见表1。

2.4肝组织TG生化变化异烟肼高剂量组肝组织TG为(16.674±1.697)mg/g 肝重量，高于正常对照组(12.015±1.739 )mg/g 肝重量和异烟肼低剂量组(13.815±2.298)mg/g 肝重量，差异有统计学意义(F=11.845,P<0.001)。

2.5肝脏病理学改变光镜下，正常对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞大小及形态正常。异烟肼组大鼠肝细胞可见脂肪变性，部分存在点状肝细胞坏死、炎性细胞浸润，其中异烟肼高剂量脂肪变性更明显。见图 2。

2.6肝脏p-ACC表达情况免疫组织化学染色结果显示，正常对照组肝细胞质中有p-ACC表达的黄色颗粒。与正常对照组比较，异烟肼组p-ACC表达的强度和范围减少，且异烟肼高剂量组更明显。与正常对照组OD值(0.226±0.023)比较，异烟肼低剂量组(0.187±0.008)和异烟肼高剂量组(0.180±0.008)p-ACC的OD值均明显低于正常对照组(F=10.932，P<0.001)。见图3。

2.7肝组织AMPK及p-AMPK、FAS蛋白表达情况与正常对照组比较，异烟肼组AMPK表达均无明显差异。低剂量、高剂量异烟肼组p-AMPK/AMPK灰度比值分别为(0.164±0.004)、(0.155±0.004)，均低于正常对照组(0.880±0.015)，差异有统计学意义(F=5 715.645，P<0.001)，提示表达明显减少。异烟肼低剂量、高剂量组FAS灰度分别为(0.639±0.038)、(1.230±0.044)，高于正常对照组 (0.187±0.007)，提示表达增加，差异有统计学意义(F=718.268，P<0.001)。见图4。

表1 各组大鼠肝指数及血清生化指标

与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

图2 各组大鼠肝脏病理学变化 HE×400

图3 各组大鼠肝脏p-ACC的表达情况 免疫组化×400

图4 Western blot法检测肝组织AMPK、p-AMPK和FAS表达情况

A：p-AMPK表达；B：FAS表达；1：正常对照组；2：异烟肼低剂量组；3：异烟肼高剂量组；与正常对照组比较：***P<0.001

3 讨论

本实验结果表明，异烟肼处理2周可导致大鼠肝细胞脂肪变性，部分存在点状肝细胞坏死、炎症细胞浸润。与文献[5]报道一致。结果显示，异烟肼组的大鼠血清ALT、AST高于正常对照组，异烟肼组的肝形态学改变，且高剂量组表现严重，表明本研究建立异烟肼致肝损伤模型成功。本研究中，肝脏组织及血清中TG含量均增加，且高剂量组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示异烟肼可引起肝细胞内TG含量增加造成肝细胞脂肪变性。

肝细胞脂肪变性的发生与脂肪酸的摄取、合成及氧化障碍有关。AMPK是一种应激敏感性激酶，激活AMPK可通过促进糖酵解和脂肪酸氧化；引起ACC磷酸化增加，抑制ACC活性；抑制FAS表达减少，引起脂肪酸合成减少[3-4,6-8]；还可通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体 α(PPARα) 来促进脂肪分解[9]。因而，在肝脏脂质稳态调节中发挥重要作用。研究[6-8]表明，AMPK磷酸化的抑制参与了非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝的发病过程。研究[10]显示，给予AMPK敲除的小鼠高脂饲料喂养，第5周时即出现肝脂肪变，血糖升高及胰岛素抵抗；而正常组小鼠第12周时才出现肝脂肪变。本研究结果显示，异烟肼处理2周后大鼠肝脏AMPK磷酸化水平显著下降，伴随着ACC磷酸化水平的减低，即ACC活性增加和FAS表达的增加，提示AMPK磷酸化下降及其下游参与脂肪酸合成的ACC及FAS增加参与了异烟肼所致的大鼠肝损伤的病理过程。

AMPK是一种重要的能量稳态传感器，参与细胞能量水平和代谢压力的调节，具有较为复杂的活性调节机制，在肝组织中，AMPKα1为最常见的催化亚基，受TGF-β活化激酶-1、肝激酶B1以及钙调蛋白依赖性蛋白激酶(calmodulin- dependent protein kinasekinase，CaMKK)3种激酶调节，负责活化磷酸化基团，生理AMP/ADP增加的细胞应激，如低氧、饥饿或葡萄糖剥夺，也可激活AMPK磷酸化[6,11]。异烟肼抑制肝脏AMPK磷酸化的可能机制：① 异烟肼在体内代谢为乙酰肼和肼，异烟肼在肝内经P-450还原后，产生亲电子基、自由基、氧基等毒性代谢产物，破坏肝细胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使细胞内外环境Ca2+的稳态被破坏，肝化学毒性损害时通过Ca2+浓度下降并抑制相关酶形成，如AMPK磷酸化上游激酶，CaMKK-β，抑制AMPK磷酸化[10,12-13]；② SIRT1-AMPK通路的抑制作用：前期研究[14]显示，异烟肼和利福平合用减少肝脏SIRT1表达。文献[15]报道，激活SIRT1/AMPK通路可以减轻肝损伤，提示异烟肼可能会通过SIRT1/AMPK通路抑制AMPK磷酸化，但确切机制尚有待探讨。

本研究表明，异烟肼可通过抑制AMPK磷酸化，抑制ACC磷酸化，上调FAS表达，造成肝细胞内TG沉积，导致肝细胞脂肪变性。提示AMPK磷酸化有可能成为防治异烟肼所致肝损伤的脂肪变性的一个治疗靶点。