电离辐射诱导肺上皮细胞发生上皮间质转化

梁 鑫, 潘秀颉, 李雪萍,3, 孙泽文,4, 杨陟华, 顾永清,5, 朱茂祥,5

电离辐射诱发的放射性肺纤维化(radiation-induced pulmonary fibrosis, RPF)是胸部肿瘤放射治疗的常见并发症，成纤维细胞是肺纤维化中的关键效应细胞，有研究[1]显示受损的肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ, AECⅡ)能通过上皮间充质转化 (epithelial mesenchymal transition, EMT)的方式间接转化为成纤维细胞。EMT是指完全分化的上皮细胞失去极性、细胞间的黏附等上皮细胞的特征，获得迁移、分化等间质细胞特征，转化成完全分化的间质细胞的过程[2]。EMT在胚胎的形成与发育、肿瘤的侵袭与转移，以及组织愈合和器官纤维化等生理和病理过程中起着重要的作用[3]。然而电离辐射诱导肺上皮细胞发生EMT的机制，及EMT在RPF发生中的作用尚不清楚。该研究首先对小鼠AECⅡ进行了分离、纯化及鉴定，确定提纯方法后，采用60Coγ射线照射小鼠提取AECⅡ，检测其EMT发生情况。随后γ射线照射几种人源的上皮细胞系并检测EMT发生情况，从而为进一步研究电离辐射诱导的EMT在RPF发生中的作用及机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及细胞 SPF级雄性C57BL/6小鼠，12只，8周龄，购自北京维通利华生物科技有限公司，动物许可证号：SCKK(京)2012-0001，完全随机分为对照组(0 Gy)和照射组(20 Gy)，饲养于军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所实验动物中心。A549细胞、Beas-2B细胞和BEP-2D细胞均为本实验室保存。

1.1.2主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibico公司)；表面活性蛋白C(prosurfactant protein C，SPC)抗体(ab40879)、紧密连接蛋白ZO-1(tight junction protein ZO-1，ZO-1)抗体(ab150266)(美国abcam公司)；E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体(562526)(美国BD Pharmingen公司)；N-钙黏蛋白(N-cadherin)抗体(17-3259，美国Ebioscience公司)；PE标记的羊抗兔抗体(GM200G-40C，天津三箭公司)。

1.2方法

图1 小鼠AECⅡ的分离与纯化

1.2.1小鼠AECⅡ的分离与纯化 小鼠经脱颈处死后于75%乙醇中浸泡5 min，在超净台中取下完整肺组织，PBS漂洗至上清液清亮；移肺入无菌50 ml离心管，剪成 1 mm3大小，按 2 ml/只小鼠加入 0.1% 的胰酶 37 ℃孵育 10 min，用等量的含10% FBS的DMEM培养液终止消化；4 ℃、1 500 r/min离心5 min，去除上清液后按 2 ml/只小鼠加入0.1% 胶原酶吹打混匀，37 ℃孵育15 min后4 ℃、3 000 r/min，离心5 min，培养液重悬后于200目筛网过滤，4 ℃、1 500 r/min离心5 min，离心重悬后取出一部分细胞待测，之后通过800 r/min离心2次，每次5 min、40 μm筛网过滤等方法对细胞进行纯化，离心重悬后各取出一部分细胞用于流式检测。

1.2.2小鼠ACEⅡ的鉴定 流式细胞术检测提取的AECⅡ中SPC阳性的比率以确定纯度，透射电子显微镜观察细胞结构。

1.2.3辐射诱导小鼠AECⅡ发生EMT的检测 小鼠用1%的戊巴比妥钠麻醉(麻醉剂量50 mg/kg)后固定于照射装置上，10 cm厚铅砖屏蔽除胸部以外的其他部位，采用60Coγ射线20 Gy单次照射全胸，剂量率215 cGy/min。照射14 d后，取对照、照射小鼠各3只，提取AECⅡ，标记E-cadherin、ZO-1和N-cadherin抗体，流式细胞仪检测。

1.2.4辐射诱导A549细胞、Beas-2B细胞和BEP-2D细胞发生EMT的检测 采用60Coγ射线8 Gy照射A549细胞、Beas-2B细胞和BEP-2D细胞，培养48 h后A549细胞用0.25%胰酶消化2 min，BEP-2D细胞用0.25%胰酶在37 ℃孵箱消化5 min，Beas-2B细胞用0.05%胰酶消化30 s，分别加入含10% FBS的DMEM培养液终止消化，4 ℃、1 500 r/min离心5 min，PBS清洗重悬后分别标记E-cadherin、ZO-1和N-cadherin抗体，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1小鼠AECⅡ的分离与纯化为了探究电离辐射是否能诱导小鼠AECⅡ发生EMT，首先对小鼠AECⅡ进行了分离，经过胰酶消化、离心等步骤得到AECⅡ，将获得的AECⅡ标记SPC抗体进行流式检测，得到SPC阳性表达率为70.8%(图1A)。随后经过800 r/min离心和40 μm筛网过滤等步骤对AECⅡ进行纯化，流式检测SPC表达阳性的细胞所占比例逐步增加，分别达到 85.2%和87.1%(图1B、1C)。提示通过该方法能够得到纯度较高的小鼠AECⅡ。

2.2小鼠AECⅡ的电镜观察鉴定为了对小鼠AECⅡ进行进一步的鉴定，将经过纯化的AECⅡ培养48 h，之后进行电镜观察，电镜下可观察到小鼠AECⅡ外侧有微绒毛，细胞核明显，细胞质较多，并能观察到特征性的板层小体结构(图2)。

图2 电镜观察小鼠AECⅡ形态 ×3 200

A：小鼠AECⅡ整体形态；B：小鼠AECⅡ特征性板层小体结构

2.3电离辐射对小鼠AECⅡ的影响经过上述方法，能够得到纯度较高的小鼠AECⅡ。为了进一步研究电离辐射是否能使小鼠AECⅡ发生EMT，从对照组小鼠与照射14 d的小鼠的肺组织中提取AECⅡ并进行流式检测。以上皮标志E-cadherin和ZO-1的表达率为横坐标，N-cadherin的表达率为纵坐标，以上皮标志和间质标志共同表达于同一细胞，即第一象限(E-cadherin+N-cadherin+的象限和ZO-1+N-cadherin+的象限)表示正在发生EMT的细胞(图3)。流式细胞仪检测E-cadherin+N-cadherin+AECⅡ比例及ZO-1+N-cadherin+AECⅡ比例，结果显示照射后的小鼠AECⅡ中E-cadherin+N-cadherin+AECⅡ比例及ZO-1+N-cadherin+AECⅡ比例明显升高(P<0.05)(表1)，表明正在发生EMT的细胞增多，提示辐射能够诱导小鼠AECⅡ发生EMT。

图3 电离辐射对小鼠AECⅡ形态及上皮、间质标志物的影响

A：流式检测EMT相关蛋白；B：照射前后发生EMT细胞相对比例(照射20 Gy组正在发生EMT的细胞/0 Gy组正在发生EMT的细胞)柱形图；与0 Gy组比较：*P<0.05

表1 流式细胞术检测电离辐射对不同细胞发生EMT的影响

2.4电离辐射对人上皮细胞系的影响

2.4.1电离辐射对人肺腺癌细胞系A549细胞的影响 根据上述实验结果，证实电离辐射能够诱导小鼠AECⅡ发生EMT，但其对人上皮细胞系的作用尚未证实，因此采用60Coγ射线8 Gy照射人肺腺癌细胞系A549细胞以及人支气管上皮细胞Beas-2B细胞和BEP-2D细胞，以探究电离辐射是否能够诱导人上皮细胞系发生EMT。

首先观察了人肺腺癌细胞系A549细胞，A549细胞照射后继续培养48 h，于光镜下观察，对照组细胞形态呈立方形或小鹅卵石形，具有上皮细胞典型的铺路石样特征；照射组与对照组相比细胞间隙增大，极性消失，形态有长梭形改变(图4A)。流式细胞仪检测E-cadherin+N-cadherin+细胞比例及ZO-1+N-cadherin+细胞比例。结果显示照射后E-cadherin+N-cadherin+细胞比例及ZO-1+N-cadherin+细胞比例明显升高(P<0.05)(图4B、4C)。表明电离辐射能够诱导人肺腺癌细胞系A549细胞发生EMT。

图4 电离辐射对A549细胞形态及上皮、间质标志物的影响

A：光镜下检测A549细胞形态×400；B：流式检测EMT相关蛋白；C：照射前后发生EMT细胞相对比例柱形图；与0 Gy组比较：*P<0.05

2.4.2电离辐射对人支气管上皮细胞的影响 光镜下观察Beas-2B细胞和BEP-2D细胞，细胞形态呈立方形铺路石样特征；照射48 h后，细胞间隙均增大，形态逐渐向纺锤样细胞形态转变(图5A、5D)。流式细胞仪分别检测到照射后的两种细胞E-cadherin+N-cadherin+细胞比例及ZO-1+N-cadherin+细胞比例与对照组相比均有明显升高(P<0.05)(图5B、5C、5E、5F)。表明电离辐射能够诱导人支气管上皮细胞Beas-2B细胞和BEP-2D细胞发生EMT。

3 讨论

肺纤维化是以多种原因引起的上皮细胞受损、修复障碍，从而导致大量细胞因子释放、细胞外基质沉积、异常间质细胞活化和增生为特征的疾病[4]。大量间质细胞(成纤维细胞、肌成纤维细胞)积聚及增殖是肺纤维化发生的重要原因[5]。肺泡上皮细胞是多种原因导致的肺损伤的主要受损靶细胞，当损伤的肺组织进行正常修复时，残存的AECⅡ可通过自身增殖或者因具有部分干细胞特性而分化为AECI，或通过上皮间质转化机制向成纤维细胞特性分化，若其转化过多的成纤维细胞，则组织病理表现为肺纤维化[6]。

EMT是指具有极性的上皮细胞在某些生理或病理因子的刺激下，经过多重生化改变，最终呈现出间质细胞表型的生物学过程[7]。EMT分为三型，Ⅰ型EMT与胚胎的形成以及器官的发育密切相关，Ⅱ型 EMT与伤口愈合、组织再生和器官纤维化有关，Ⅲ型 EMT与肿瘤的侵袭与转移相关。本研究重点关注Ⅱ型 EMT即 EMT与器官纤维化的关系。

近年来的研究[8-9]表明小鼠肺纤维化模型中超过30%的成纤维细胞来自于EMT过程，EMT在肺纤维化中扮演着重要的角色。高烨 等[10]的实验结果表明EMT在百草枯诱导的肺纤维化中起着重要作用。还有研究[11]显示EMT过程出现在博莱霉素诱导的肺纤维化中。电离辐射诱导的肺损伤和肺纤维化是接受胸部放射治疗、骨髓移植或参与核事故的患者常见且严重的并发症[12-14]，也是导致这些患者治疗后期死亡的主要原因之一。由于RPF的机制尚不清楚，目前还缺乏有效的治疗方法。因此，对RPF形成机制的研究尤为重要。然而，尽管EMT与多种因素引起的肺纤维化密切相关，电离辐射诱导EMT发生及其在RPF中的作用却鲜有报道。同时大部分关于EMT与肺纤维化的研究主要采用A549 细胞和Beas-2B细胞建立细胞模型，基于AECⅡ在参与肺纤维化形成过程中的重要作用，本研究首次将小鼠原代AECⅡ分离、纯化并用于电离辐射诱导EMT的研究。EMT发生时，上皮细胞向间充质细胞转移，失去细胞间E-cadherin和ZO-1的表达，获得N-cadherin的表达[3,15]。很多情况下，细胞发生不完全的间质化，同一细胞同时表现出上皮和间充质特性[16]，因此主要对这部分细胞进行了检测。检测的方法主要采用流式细胞术，这种方法能够高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，能够高效地对所得数据进行定量分析。本研究结果表明电离辐射确实能够在多种肺上皮细胞中诱导EMT的发生，使肺上皮细胞向成纤维细胞特性分化，进而增加引起RPF的可能性。同时，以ZO-1+N-cadherin+表示的发生EMT的AECⅡ细胞在电离辐射诱导后较对照组增加了7倍之多，这一比例高于其他几种细胞系，表明小鼠原代AECⅡ是用于RPF研究的较为理想的细胞。本研究为探讨AECⅡ在放射性肺纤维化中的作用提供了新的方法，并为进一步研究EMT在放射性肺纤维化中的调控机制以及寻找RPF的有效的治疗靶点提供了新的思路。

图5 电离辐射对Beas-2B细胞和BEP-2D细胞形态及上皮、间质标志物的影响

A：光镜下检测Beas-2B细胞形态×400；B：流式检测Beas-2B细胞EMT相关蛋白； C：照射前后Beas-2B细胞发生EMT细胞相对比例柱形图；与0 Gy组比较：*P<0.05；D：光镜下检测BEP-2D细胞形态×400；E：流式检测BEP-2D细胞EMT相关蛋白；F：照射前后BEP-2D细胞发生EMT细胞相对比例柱形图；与0 Gy组比较：*P<0.05