对氨基苯甲酸修饰的金纳米粒子比色法检测水样中痕量杀螟丹

易 永， 肖石妹， 郭 岚*,， 鄢爱平， 姚恬恬， 万益群,

(1.南昌大学化学学院，江西南昌,330031;2.南昌大学分析测试中心，江西南昌,330047;3.江西省分析测试研究所，江西南昌,330000)

杀螟丹(2-(二甲氨基)-1，3-丙二硫醇二氨基甲酸甲酯盐酸盐)是一种模拟沙蚕毒素合成的仿生性农药，1967年在日本首次应用[1]。杀螟丹作为一种高效杀虫剂，被广泛应用于水稻、果树、蔬菜、茶树和甘蔗等农作物的生产中，其用量极大，目前全世界杀螟丹的需求量约为8 000吨/年。因为杀螟丹的毒性，尤其对水生生物毒性极高，其大量使用所产生的残留必然对生态环境产生不良的影响，进而对人体健康造成威胁[2-3]，因此国内外相关部门对农作物、食品中杀螟丹的含量做出了相关限制和规定[4]。

目前检测杀螟丹主要采用高效液相色谱[5]、气相色谱[6]、气相色谱-质谱[7]、液相色谱-质谱[8]和薄层色谱[9]等方法。此类方法虽然灵敏度较高，但仪器设备昂贵、分析时间长且样品前处理复杂，因此发展快速、简单、低成本的有效检测方法具有实际应用价值。

随着纳米科学的发展，基于贵金属纳米粒子的比色法因为具有可视性、简单、灵敏、实时分析等优点而受到广泛关注[10-11]。其中金纳米粒子(AuNPs)由于具有高的摩尔吸光系数、稳定性强以及易被有机配体修饰等特性而成为最受欢迎的贵金属纳米材料，目前已有许多文献报道利用AuNPs比色法检测金属离子[12-13]、氨基酸[14]、有机污染物[15]和农药残留[16-17]等物质。本文以对氨基苯甲酸修饰的AuNPs为探针，提出了一种检测杀螟丹的比色方法。该方法简单、快速、灵敏、选择性好，可应用于环境水样中的痕量杀螟丹的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2501PC紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；JEM-2100透射电镜(日本，电子公司)；Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪(美国，尼高力公司)；PSA NANO 2590纳米粒度仪及Zeta电位分析仪(英国，马尔文公司)。

农药标准品：杀螟丹、西维因、噻草平、虫螨威、氯苯胺灵、害扑威、福美双、甲磺隆、甲胺磷、氯草灵、完灭硫磷、甲基硫菌灵、百菌清、雷多米尔、乙酰甲胺磷、杀螟硫磷、杀虫环和杀虫双，均购自百灵威科技有限公司。HAuCl4·4H2O(百灵威科技有限公司)；对氨基苯甲酸(PABA)、三水合柠檬酸钠(上海晶纯生化科技股份有限公司)；NaCl、MgCl2、ZnCl2、KCl、CaCl2、AlCl3、FeCl3、CuCl2、MnCl2、Na2CO3、NaHPO4、NaNO3、K2SO4、HAc、NaAc(国药集团化学试剂有限公司)；上述试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

1.2.1AuNPs的合成AuNPs采用柠檬酸钠还原法[18]制备。将50 mL HAuCl4溶液(0.25 mmol/L) 加热至沸并持续5 min，向溶液中快速加入 1.3 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续加热反应约15 min，当溶液变成酒红色之后即为反应终点，可得到粒径约为13 nm的AuNPs，保存于4 ℃冰箱中，备用。AuNPs的浓度根据比尔定律计算确定为5 nmol/L(13 nm的AuNPs在最大吸收波长520 nm的摩尔吸光系数ε为2.78×108L·mol-1·cm- 1。

1.2.2PABA-AuNPs的合成将0.05 mL PABA(30 μmol/L)加入到 4 mL AuNPs溶液 (5 nmol/L)中，使PABA和AuNPs的投料摩尔比为75∶1,在室温下孵育2 h得到PABA修饰的AuNPs，即PABA-AuNPs。

1.2.3吸收光谱的扫描在10 mL塑料离心管中，加入0.5 mL HAc-NaAc缓冲溶液(pH=5.5)和4 mL PABA-AuNPs 溶液，再加入0.1 mL杀螟丹标准溶液或样品溶液，用超纯水定容至5 mL。混合均匀后，室温下孵育4 min，用1 cm石英比色皿，以超纯水为参比，用紫外-可见分光光度计扫描得到400～800 nm波长范围内吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

2.1.1AuNPs的表征合成得到的AuNPs溶液颜色为酒红色，通过纳米粒度仪和紫外-可见分光光度计对其进行表征。实验结果表明合成得到的纳米材料平均粒径为13 nm，最大吸收波长为520 nm，与文献报道[18]一致，说明成功合成了AuNPs。

图1 PABA(a)和 PABA-AuNPs(b)的红外光谱图Fig.1 The infrared spectra of PABA(a) and PABA-AuNPs(b)

2.1.2PABA-AuNPs的表征通过傅立叶红外光谱以及透射电镜对制备好的PABA-AuNPs进行表征。图1给出了PABA和PABA-AuNPs的红外特征吸收谱图。PABA有两个功能团，氨基和羧基。从图中可以明显看到PABA在3 401 cm-1和 3 493 cm-1有吸收，分别对应氨基的对称和非对称伸缩振动谱带，然而在PABA-AuNPs红外光谱图中，这两个峰却消失了，但羧基的C=O 伸缩振动峰(1 704 cm-1)和O-H的伸缩振动峰(3 081 cm-1)仍然存在。结果表明已成功合成了PABA-AuNPs，而且PABA是通过氨基修饰到了AuNPs粒子的表面，而把羧基暴露在外面。由透射电镜图可以看出PABA-AuNPs呈球形且分散均匀，平均粒径约13 nm(图2A)，当向溶液中加入0.6 mg/L的杀螟丹后，PABA-AuNPs迅速发生聚集(图2B)。

图2 PABA-AuNPs(A)和加入0.6 mg/L杀螟丹后PABA-AuNPs(B)的透射电镜(TEM)图Fig.2 TEM images of PABA-AuNPs(A) and PABA-AuNPs after the addition of 0.6 mg/L cartap(B)

2.2 PABA-AuNPs探针比色法检测杀螟丹

对PABA-AuNPs表面进行了电位分析，测得材料表面Zeta电位为-56.2 mV，这应该是由于材料表面存在大量羧基的缘故。由于PABA-AuNPs表面的负电荷存在静电排斥作用，因此粒子呈现出良好的分散状态。当加入杀螟丹后，杀螟丹的氨基作为氢键给体会与AuNPs表面的羧基形成氢键，诱导AuNPs发生聚集，机理如图3所示。

图3 PABA-AuNPs比色法检测杀螟丹原理图Fig.3 The possible mechanism of cartap detection using the PABA-AuNPs colorimetric assay

图4 PABA-AuNPs在加入杀螟丹前(a)后(b)的吸收光谱(pH=5.5)Fig.4 Absorption spectra of PABA-AuNPs solution in the presence of none(a),0.6 mg/L cartap(b),the determination medium is acetic acid-sodium acetate buffer solution(pH=5.5) (Insert a-b is corresponding photos of two samples mentioned above)

溶液中处于良好分散状态的PABA-AuNPs呈酒红色，吸收光谱如图4曲线a所示，在520 nm处有最大吸收峰。当向PABA-AuNPs中加入杀螟丹后，溶液的颜色从酒红色变成蓝色，吸收光谱如图4曲线b所示，520 nm处的吸收强度降低，在690 nm处出现了新吸收峰，表明AuNPs发生了聚集。在PABA-AuNPs溶液中分别加入0、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mg/L杀螟丹溶液，测得纳米粒子的平均粒径分别为13、29、145、191、531和1 271 nm。实验结果进一步推断出杀螟丹的加入引起了PABA-AuNPs的聚集，而且聚集程度与杀螟丹的浓度呈正相关。

2.3 实验条件的优化

2.3.1合成PABA-AuNPs投料比的影响将PABA修饰在AuNPs表面，一方面使AuNPs表面带负电荷，以维持相对稳定的分散体系，另一方面在AuNPs表面提供杀螟丹的识别位点。实验采用摩尔比(nPABA∶nAuNPs)分别为50∶1、75∶1、100∶1、150∶1进行投料，合成了4种PABA-AuNPs，并对其检测杀螟丹的效果分别进行了实验，如图5所示。由图可知，当投料比为75∶1时，PABA-AuNPs对杀螟丹的识别灵敏度最高且线性范围最宽；当投料比低于75∶1时，修饰到AuNPs上的PABA太少，导致杀螟丹的识别灵敏度降低；而当投料比高于75∶1时，过量的PABA会导致PABA-AuNPs溶液发生一定程度上的聚集，使得线性范围变窄且灵敏度降低。因此本实验最终选择75∶1作为最佳投料比。

2.3.2溶液pH和反应时间的影响实验考察了溶液pH对杀螟丹检测灵敏度的影响。从图6中可以看出，由于杀螟丹在碱性条件下不稳定，随着pH的升高，吸光度的比值明显下降。在酸性条件下，由于水合质子容易与羧基的孤对电子形成氢键，对杀螟丹中氨基造成竞争，因此随着pH的降低，对杀螟丹的识别灵敏度急剧下降。实验最终选择pH=5.5作为后续实验的最佳条件。同时考察反应平衡时间的影响，4 min 之后颜色和吸光度比值都不再改变，因此选择4 min为反应时间。

图5 不同投料比合成的PABA-AuNPs对杀螟丹的响应(pH=5.5)Fig.5 The absorption intensity ratio (A690nm/A520nm,nPABA∶nAuNPs) of these four types of PABA-AuNPs as a function of cartap concentrations(pH=5.5)

图6 pH值条件的优化(c杀螟丹=0.6 mg/L)Fig.6 Optimization of pH (ccartap=0.6 mg/L)

2.4 干扰实验

2.5 PABA-AuNPs溶液的稳定性

实验对PABA-AuNPs 的稳定性进行了三个月的跟踪考察，发现在此期间，纳米粒子平均粒径稳定在13 nm左右，未出现团聚现象，说明合成的PABA-AuNPs具有良好的稳定性，有利于实际应用。

2.6 分析应用

2.6.1工作曲线及检出限在优化条件下，分别取不同浓度杀螟丹标准溶液与PABA-AuNPs反应，如图7(A) 所示，随着杀螟丹溶液浓度的增加，PABA-AuNPs在520 nm处的吸光度值逐渐降低，而在690 nm处的吸光度值逐渐升高，且颜色的变化可以通过肉眼观察到，见图7(A)中的内插图。以A690nm/A520nm对杀螟丹浓度作图，见图7(B)。当杀螟丹浓度在0.08～0.7 mg/L范围时，线性回归方程为:y=1.5833c-0.00836，相关系数(R2)为0.9957；当杀螟丹浓度在0.75～1.0 mg/L范围时，线性方程为:y=0.75429c+0.57667,R2=0.9914(分别对应图7(B)中的a和b)。根据检测限公式：3S0/K，S0是测量空白时的标准偏差(n=13)，K是校准曲线的斜率，得到紫外-可见分光光度法的检测限为0.02 mg/L。裸眼检测限为0.15 mg/L。

2.6.2样品检测对实际环境水样中杀螟丹含量进行测定(水样先用砂芯漏斗过滤，然后过0.45 μm水相膜)，并进行加标回收实验，结果见表1。实际水样的加标回收率在101%～107%之间，相对标准偏差(RSD)在2.1%～4.7%之间。此结果表明，本方法在环境水样中检测可行。

图7 (A)不同浓度杀螟丹的PABA-AuNPs的吸收光谱图(内插图是比色图片)；(B)杀螟丹的标准曲线(pH=5.5)Fig.7 (A)Absorption spectra of the PABA-AuNPs in the presence of different concentrations of cartap(Inset is the selected photograph);(B)Calibration curve of absorption ratio(A690nm/A520nm) versus cartap concentration (pH=5.5)

SampleFound(mg/L)Added(mg/L)Average recovery(%)RSD(%)SampleFound(mg/L)Added(mg/L)Average recovery(%)RSD(%)Qingshan lake waterND0.20.40.61061021034.74.22.1Rice field waterND0.20.40.61041051044.43.73.3Yao lake waterND0.20.40.61071051013.52.92.1Rice field waterND0.20.40.61051041014.54.13.8

ND:not detected.

3 结论

以合成的PABA-AuNPs为探针，通过其与杀螟丹的氢键作用产生不同程度的聚集，而引起金纳米粒子溶液颜色的改变，建立了一种杀螟丹的比色检测新方法。该方法简单快速，分析成本低，不需要复杂的仪器设备，甚至用裸眼观测即能得到不错的灵敏度，具有较好的应用前景。