黄腐酸对苜蓿固氮效率及产量的影响研究

邱小倩 许原原 王若楠 李宝珍 杨金水 袁红莉

中国农业大学生物学院 北京100193

苜蓿营养价值高，含有丰富的矿物质、多种维生素、微量元素及胡萝卜素，适口性好，是各种牲畜最喜食的牧草，被誉为“牧草之王”。自2012年国家实施“振兴奶业苜蓿发展行动”计划以来，我国苜蓿行业发展迅速，但优质苜蓿产量仍严重供不应求，预计到2020年全国优质苜蓿总需求量将达到610万吨。此外，近年来化肥过量使用造成的土壤环境问题日益突出，豆科植物与根瘤菌共生能将自然界中植物难以直接利用的氮转化为可直接利用的氨[1]，减少氮肥使用的同时，还起到改善土壤理化性质，提高土壤肥力的作用，对农业可持续发展具有重要意义。提高豆科植物与根瘤菌的结瘤固氮效率，增加豆科植物产量，不仅具有经济价值，而且是解决化肥过量使用的有效途径之一。

黄腐酸可以促进豆科植物结瘤固氮。早在1983年，Tan等[2]就发现黄腐酸可以使大豆、花生等豆科植物的根瘤干重增加。Rezazadeh等[3]也发现，喷施黄腐酸后豇豆的结瘤数增加了16.15%，根瘤的含氮量增加12.95%。栾白等[4]发现，适宜浓度的黄腐酸能提高大豆种子的萌发率，显著提高其抗氧化酶的活性，促进种子的萌发。Gao等[5]通过差异蛋白质组学的方法发现微生物降解褐煤生成的黄腐酸可以加快大豆根瘤菌（Bradyrhizobium liaoningense CCBAU05525）的代谢和营养摄入，提高大豆根瘤菌的细胞密度，并且诱导根瘤菌nod基因的表达，最终促进大豆的结瘤固氮。

本研究在大田试验条件下，对豆科牧草——紫花苜蓿进行喷施黄腐酸及接种根瘤菌处理，研究黄腐酸对苜蓿结瘤固氮及产量的影响，以期为黄腐酸在牧草种植上的大面积应用，以及减少氮肥施用条件下提高牧草产量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄腐酸

采用本研究室专利技术“微生物降解生产黄腐酸方法（ZL02158189.4）”[6]中描述的方法发酵生产黄腐酸。发酵后产物的提取方法如下：10 g褐煤发酵产物加入100 mL去离子水，搅拌12 h后，10000 rpm，15 min离心3次，上清液经真空抽滤进一步去除固体不溶物后，40 ℃烘干备用。

根据Gao等[5]研究结果确定黄腐酸的使用浓度为0.5 g/L。

1.1.2 试验根瘤菌菌株

Sinorhizobium meliloti CCBAU01290，由中国农业大学根瘤菌研究中心提供，分离自内蒙古地区，经田间试验证明能与紫花苜蓿（“敖汉”）高效结瘤固氮[7]。

1.1.3 苜蓿品种

“中苜一号”紫花苜蓿（Medicago sativa L.），购买自中国农业科学院畜牧研究所。

1.1.4 试验地概况

试验于2013—2015年在北京市顺义区农业科学研究所基地（40°5′N，116°16′E）进行。经检测，土壤有机质含量为14.2 g/kg，全氮含量为1.02 g/kg，碱解氮含量为121 mg/kg，有效磷含量为68.8 mg/kg，速效钾含量为173 mg/kg，土壤pH为7.88。在苜蓿播种前平整土地，同时每亩地施加1250 kg有机肥作为底肥。

1.2 试验设计及方法

1.2.1 试验设计

苜蓿于2013年9月2日播种，行距30 cm，播种量1千克/亩，田间常规管理。试验设3个处理：对照（喷施等量清水）；喷施黄腐酸；接种根瘤菌。每个处理5次重复，随机分布，每个小区面积为20 m2。

1.2.2 方法

喷施黄腐酸处理：苜蓿播种后，将0.5 g/L的黄腐酸溶液按照每亩地50 L的量均匀喷洒到播种的沟穴内，然后再覆土。

接种根瘤菌处理：根瘤菌在YMA平板上活化2次后，接种至YMA液体培养基中培养3天，使菌体密度达到1010～1011cfu/mL。

接种方式：苜蓿播种到沟穴后，将适当稀释后的菌悬液按照活菌数约107个/粒种子均匀喷洒到种子上（每亩地约需要150 mL菌剂），然后再覆土。

2015年第1次刈割（2015年5月22日）25天后，除对照外，各个处理在苜蓿根部再一次均匀喷施黄腐酸。

1.3 样品采集与测定

1.3.1 样品采集

在2013年11月6日，即苜蓿种植2个月后，在各个处理每个小区内随机选取长势大小一致的10株苜蓿，统计结瘤数并称量根瘤鲜重，检测苜蓿的结瘤情况。分别在2014年及2015年的5、7、8月苜蓿的开花期测定苜蓿产量（地上干重，共6次）；并测定2015年第1次刈割时根瘤的固氮酶活性。

1.3.2 测定方法

根瘤数及根瘤鲜重：每个小区取10株长势大小一致的苜蓿，将带有根瘤的根剪下，洗净后放入密封袋中，带回实验室，用镊子小心将根瘤摘下，统计数量，用分析天平称重。

苜蓿产量：在每个小区内选取约2～3 m2的区域收割苜蓿直接测量鲜重，并从每份测产的样品中随机抽取约1 kg鲜苜蓿风干至恒重，计算干重，再换算为每公顷产量。

固氮酶活性：采用乙炔还原法测定[8]。[固氮酶活性=样品乙烯峰面积×瓶体积×标准乙烯的量/（标样乙烯峰面积×上样体积×瘤重×反应时间）]。

2 结果与分析

2.1 不同处理对苜蓿结瘤的影响

在苜蓿种植2个月后，检测了对照、喷施黄腐酸及接种根瘤菌处理的苜蓿根瘤数及根瘤鲜重。结果如图1所示，与对照相比，接种根瘤菌后苜蓿根瘤数增加2.29倍，且差异显著；喷施黄腐酸后使苜蓿根瘤数增加0.33倍，这说明黄腐酸在一定程度上促进了土著根瘤菌与苜蓿的结瘤。喷施黄腐酸处理的苜蓿根瘤鲜重最高，为对照的1.84倍。可见，黄腐酸对苜蓿结瘤的作用主要体现在根瘤大小上，即单个根瘤的重量上；而接种根瘤菌的处理，苜蓿根瘤鲜重与对照比虽然有所增加，但是差异不显著。

综上，喷施黄腐酸或接种根瘤菌对苜蓿的结瘤均有积极作用。

图1 不同处理对苜蓿根瘤数（A）及根瘤鲜重（B）的影响Fig.1 Effects of different treatments on the number (A) and fresh weight (B) of alfalfa nodules

2.2 不同处理对苜蓿固氮酶活性的影响

苜蓿是多年生豆科牧草，根瘤菌的接种效果是否能持续多年一直是人们关心的问题。固氮酶活性能够直接反应根瘤的固氮能力，因此我们选择在第2年（2015年）第1次刈割时进行固氮酶活性的测定，以检测所施加的黄腐酸及接种的根瘤菌是否仍能促进苜蓿的共生固氮效率。

图2为不同处理对苜蓿根瘤固氮酶活性的影响。结果显示，喷施黄腐酸和接种根瘤菌的2个处理的固氮酶活性显著高于对照：喷施黄腐酸处理显著提高了苜蓿根瘤的固氮酶活性，说明黄腐酸不仅促进土著根瘤菌与苜蓿结瘤，还可提高其单位质量根瘤的固氮效率，显著提高土著根瘤菌与苜蓿的结瘤固氮效率；接种根瘤菌的处理，苜蓿植株固氮酶活性显著高于对照，说明接种的根瘤菌在经过冬季低温后，在翌年春天仍然能够发挥一定的作用，且其固氮效率高于土著根瘤菌。

图2 不同处理对苜蓿根瘤固氮酶活性的影响Fig.2 Effects of different treatments on nitrogenase activity of alfalfa nodules

2.3 不同处理对苜蓿产量的影响

苜蓿在开花期测定其产量，于2014年及2015年的5、7、8月共6次连续2年对苜蓿产量进行了测定。2014年苜蓿测产结果如表1所示，与对照的年产量16324.79 kg/hm2相比，喷施黄腐酸处理苜蓿年产量为21152.5 kg/hm2，增产达29.57%，而接种根瘤菌处理苜蓿年产量为18001.65 kg/hm2，增产10.27%。

2015年苜蓿测产结果如表2所示。对照处理苜蓿年产量为15934.22 kg/hm2；喷施黄腐酸处理苜蓿年产量为19176.39 kg/hm2，比对照增产20.35%；接种根瘤菌处理苜蓿年产量为20609.28 kg/hm2，比对照增产29.34%，增产效果明显。由表2可以看出，在2015年6月重新补施黄腐酸后，与对照相比，第2次刈割苜蓿的产量虽没有显著增加，但第3次刈割的产量较对照而言明显提高。也就是说，在苜蓿过冬后的春天，苜蓿返青时补施黄腐酸，能显著增加第2年苜蓿的产量。对2年的产量进行统计可以发现，喷施黄腐酸及根瘤菌处理相比对照（年产量32259.01 kg/hm2）苜蓿分别增产25.02%和19.69%。以上结果说明，喷施黄腐酸及接种根瘤菌对苜蓿生长具有明显的促进效果。

表1 2014年不同处理对苜蓿产量的影响Tab.1 Effects of different treatments on alfalfa yields in 2014

表2 2015年不同处理对苜蓿产量的影响Tab.2 Effects of different treatments on alfalfa yields in 2015

3 结论

喷施黄腐酸能够促进土著根瘤菌与苜蓿结瘤，增加根瘤数及根瘤鲜重，同时可提高单位质量根瘤固氮酶活性，进一步增加苜蓿的固氮总量，2年使苜蓿增产高达25.02%，效果甚至好于接种根瘤菌，为苜蓿在大面积种植上施用黄腐酸奠定了基础。今后，继续研究同时喷施黄腐酸并接种根瘤菌对苜蓿生长的影响，对深入揭示黄腐酸促进苜蓿结瘤固氮机理具有重要的理论和实践意义。