用正相高效液相色谱法测定经澄清剂处理后一贯煎中梓醇含量的效果观察

白 兰，郑 宇

（1.四川省医学科学院·四川省人民医院，电子科技大学附属医院·四川省人民医院，个体化药物治疗四川省重点实验室，四川 成都610072；2.成都中医药大学，四川 成都 610075）

一贯煎是一种具有滋阴疏肝功效的中药方。该方是由北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞、川楝子六味中药组成的，主要用于治疗慢性肝炎、肝硬化、慢性萎缩性胃炎、胃及十二指肠球部溃疡等疾病[1]。有研究者认为[2-3]，除了多糖以外，一贯煎中的梓醇也属于该方的有效成分。因此，本次实验使用ZTC1+1天然澄清剂Ⅲ型处理一贯煎的提取液，同时保留该方中的多糖及梓醇等非极性活性物质，旨在寻找一种测定经澄清剂处理后一贯煎中梓醇含量的有效方法。现报告如下。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

本次实验使用的仪器是waters2690型正相高效液相色谱仪、2996型二极管阵列检测器、美国waters公司生产的Empower Chromatography Manager 色谱数据工作站、德国Sartorius 公司生产的BP 211D 型十万分之一电子分析天平、蒸发皿、水浴锅、恒温鼓风干燥箱等。

1.2 实验试剂

本次实验使用的试剂是中国药品生物制品检定所生产的梓醇对照品、迪马公司生产的甲醇（色谱纯）、反渗透超纯水、分析纯。

2 实验方法

2.1 色谱条件

本次实验使用的色谱柱是迪马公司生产的ShimpackCLC-ODS柱（6.00mm×15cm，5μm），其流动相为甲醇-水（4:96），其检测波长为205nm，其流速为1.2 ml/min，其柱温为28℃，其进样量为10μl。按照梓醇色谱峰计算理论塔板数，其理论塔板数应不低于4000。

2.2 制备标准溶液的方法

精密称取适量的梓醇对照品，将其加入到浓度为1%的甲醇中进行溶解，将其配置成浓度为70μg/ml的标准溶液。

2.3 制备供试品溶液的方法

按照一贯煎的处方称取药材，加10倍的清水煎煮2次，每次煎煮1.5 h。对所得的药液进行滤过处理。将两次煎煮所得的药液合并后，对这些药液进行浓缩处理，使药材与药液体积的比例为1:1，以备用。将浓缩后的药液按照1:8的比例进行稀释，然后对其进行水浴处理（温度为80℃），并进行搅拌。将稀释后的浓缩液分为A组和B组。在这两组溶液中分别加入ZTC 1+1天然澄清剂Ⅲ型。两组溶液加入ZTC 1+1天然澄清剂Ⅲ型的间隔时间为120 min。A组溶液中ZTC 1+1天然澄清剂Ⅲ型的加入量为2%，B组溶液中ZTC 1+1天然澄清剂Ⅲ型的加入量为4%。将两组溶液持续搅拌30 min后取出，将其放在4℃的环境中静置24 h，对其进行滤过处理。对滤液进行浓缩，使药材与药液体积的比例为1:1，得到经ZCT 1+1天然澄清液Ⅲ型处理后的一贯煎样品。精密量取5 ml的一贯煎样品，将其置于容量为25 ml的量瓶中。在量瓶中加入适量的甲醇。对量瓶中的溶液进行超声（功率250 W，频率20 kHz）处理30 min，将溶液放冷。在量瓶中加入甲醇至刻度后，将量瓶中的溶液摇匀。使用直径为0.45μm的微孔滤膜对溶液进行滤过处理。精密量取1 ml的续滤液，将续滤液放到容量为10 ml的量瓶中，加水至刻度，然后将量瓶中的溶液摇匀，所得的药液即为供试品溶液。按照一贯煎处方中药物的用量称取除生地黄以外的其他药材，参照上述方法制备阴性样品溶液。

3 实验结果

3.1 进行线性关系实验的结果

分别精密量取 4.0μl、6.0μl、8.0μl、10.0μl、12.0μl的梓醇对照品溶液，将其分别注入到正相高效液相色谱仪中，测定梓醇对照品的峰面积。以梓醇对照品的峰面积作为纵坐标，以梓醇对照品的进样量作为横坐标，求解梓醇对照品的线性回归方程：Y= 1758758.98X+1115.60，r=0.9999。结果显示，梓醇对照品的进样量在0.28～0.84μg时的线性关系良好。

3.2 进行专属性实验的结果

分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μl，将这些溶液注入到正相高效液相色谱仪中。结果显示，在供试品溶液的色谱中，在与对照品溶液色谱相对应的位置上，有相同的保留时间，且对阴性样品溶液的色谱无干扰，说明本法具有良好的专属性。详情见图1。

图1 一贯煎中梓醇的HPLC图

3.3 进行精密度实验的结果

精密量取同一浓度的对照品溶液，按照2.1中的色谱条件，重复进样5次，记录并计算其峰面积。结果显示，对照品溶液的RSD=1.02%，表明本法的精密度良好。

3.4 进行重复性实验的结果

精密量取5 ml的同一批样品，按照2.3中的方法制备6份供试品溶液，在2.1中的色谱条件下，记录并计算供试品溶液的峰面积。结果显示，在供试品溶液中梓醇的含量为5.176 mg/ml时，其RSD=2.06%，说明本法的重复性良好。

3.5 进行稳定性实验的结果

取3.3中的一份供试品溶液，在2.1中的色谱条件下，在第0 h、第2 h、第4 h、第8 h、第12 h时进行检测，记录并计算供试品溶液的峰面积。结果显示，供试品溶液的RSD=1.91%，说明供试品溶液在常温下放置12 h的稳定性良好。

3.6 进行加样回收率实验的结果

分别精密量取2.5 ml 已知含量的9份同一批样品，将其分为三组，每组3份样品。在每组样品中分别加入一定量的对照品溶液，按照2.3中的方法制备供试品溶液，在2.1中的色谱条件下记录供试品溶液的峰面积，计算供试品溶液的回收率。结果显示，供试品溶液的平均回收率为102.46%，其RSD=1.96%。

3.7 进行样品浓度实验的结果

取3批样品，分别按照2.3的方法制备供试品溶液，在2.1的色谱条件下进样，使用外标法计算样品中梓醇的含量。结果显示，样品中梓醇的含量分别为5.176 mg/ml、5.386 mg/ml、4.908 mg/ml。

4 讨论

在进行本次实验时，课题组参考了相关文献，使用不同比例的乙腈和水作为流动相，或在供试品溶液中加入不同浓度的磷酸溶液，分离的效果均不理想。这可能是由于在经澄清剂处理后的一贯煎供试品溶液中保留的多糖成分可对梓醇含量的测定造成影响。经过更换色谱柱、改变流动相的组成及比例等方式，课题组最终找到一种测定经澄清剂处理后一贯煎中梓醇含量的有效方法，即正相高效液相色谱法。该检测方法的专属性强，测定的结果准确，可为对一贯煎制剂的定量控制提供参考。