辐射诱变及其在大豆育种中的应用

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(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 大豆分子设计育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；2.中国科学院大学，北京100049)

0 引 言

大豆(Glycinemax)原产于中国，距今已经有五千年的栽培历史[1]，是一种重要的粮油兼用作物[2]。根据FAO/IAEA的数据统计，2016年世界大豆年总产量已经达到1961年的12倍左右，但同比世界其他主产作物的单产增加幅度，大豆单产仅增加了2.4倍左右[3]，这说明世界范围内，目前增加大豆总产量的方式仍主要是扩大种植面积。然而，世界耕地资源有限，人口又不断增长，如何利用有限的种植面积，提高大豆的单产水平，培育高产且优质的大豆品种，满足人类对大豆产品的需求，是大豆育种工作所面临的一个挑战。

大豆是严格的自花授粉作物，天然异交率不到1%，因此，大豆育种中最常用的方法是杂交育种。在我国，利用杂交育种方法培育的大豆品种占已经育成的品种的88.16%[4]。但是，杂交育种具有育种周期长，可利用的突变类型和可创造的新的变异类型有限等不足，很难满足育种的实际需求。而辐射诱变育种因其具有突变率高，突变谱广，育种年限短等优点，在大豆育种中也被广泛应用。据统计，1962-2011年间，世界范围内，应用诱变育种技术共育成大豆品种175个，其中122个应用了辐射诱变育种技术[5]。本文从辐射诱变育种的原理，大豆辐射诱变的生物学效应，诱变后代的筛选方法和诱变后代主要变异类型4个方面，总结了国内外在大豆辐射诱变育种方面的研究进展，讨论分析了大豆辐射诱变育种工作中的难点，提出了辐射育种及其技术今后需要加强的几个方面，以期明确辐射诱变的作用机理，推进辐射诱变在大豆品种选育中的广泛应用。

1 辐射诱变育种的原理

19世纪中期，孟德尔发现了分离定律和自由组合定律，使遗传学成为了植物育种中一门重要的学科，杂交理论建立后植物育种进一步发展，诱变育种也随之发展[6]。辐射诱变育种是利用物理因素诱发植物产生遗传突变，从而在短时间内获得有价值的突变体，供生产研究或进行新的种质资源的培育的一种育种方法[7]。其原理是，放射源所放射的快速运动的带电粒子在通过植物体时，会与其发生能量的转移和交换，产生一系列的正负离子或激发态原子，这些离子或原子会影响到细胞内的部分生化反应，诱导植物细胞内的遗传物质发生改变，从而引发突变[8]。最早进行辐射诱变育种的是美国科学家Stadler，他在1928年首次证实了X射线对大麦具有诱导效应[9]。

大豆辐射诱变育种开始于20世纪30年代，第一个进行大豆诱变育种的是苏联的科学家列什干科，他以X射线为诱变源处理大豆种子和已经开花的植株，获得了很多类型的变异[10]。γ射线、X射线、中子、激光和重离子是大豆辐射诱变育种中最常用的诱变源。由于γ射线波长较短，相比于X射线和中子具有更好的穿透力，所以应用最为广泛。中子危险性较高且穿透能力较差，但是诱导DNA产生大片段缺失比较有效。重离子束是一种新型诱变剂，相比于其他诱变源，重离子具有较高的传能线密度(Linear Energy Transfer，简称LET)，可以在较高的存活率下获得较高的突变率，引起更为显著的生物学效应[11]。激光是利用自身多种能量的综合作用，使DNA在吸收能量后进行能量分配的过程中，发生分子结构的改变而引发突变[12]。每种方法都有相对的优势和不足，育种中要根据育种目标和其他条件的限制进行综合选择。

2 大豆辐射诱变生物学效应研究

2.1 表型水平的变化

研究表明，由于辐射对种子造成的生理损伤，在M1代，出苗时间和成熟时间会出现一定程度的延长，出苗率相比对照明显降低，且辐射剂量越大，出苗率越低。而且，随着植株的生长，很多性状会出现一定的变化，如生长缓慢，发育畸形，叶片黄化，卷曲皱缩等，植株的株高、节数、分枝数及荚数等也会出现一定变化，同时也会出现双主茎、不育株和半不育株等，很多植株不能正常生长而死亡，植株成活率下降[13-17]。M1代植株性状的很多改变都是由于生理损伤产生的，所以不会遗传给下一代，有很多隐性突变也不会在M1代显现出来。在M2代，生理损伤和畸形都会有所恢复，会分离出大量的突变，是筛选突变体的重要世代[18]，但是，很多突变都是无益突变，出现生育期和叶绿素的变异概率较高，在生育期方面甚至会出现极早到极晚的连续变异，变化幅度在5～30 d左右[19]。M3代，一般对M2代选定的候选突变体进行进一步的筛选确定，所筛选出来的突变体再经M4代种植并结合一些其他方法进一步确认，基本可确定稳定遗传。因为表型的变化最易于观察和筛选，所以研究比较广泛，利用辐射诱变技术已经发现了叶形突变体[20]、子叶折叠突变体[21]、矮化短柄突变体[22]、种皮不完整突变体[23]，早熟高产突变体和种皮颜色突变体[24]等，见图1。近年来，也有很多研究学者应用辐射诱变育种技术在表型水平构建了大豆的突变体库，在生育期，叶部性状、株型、育性、种皮颜色、蛋白质和油分含量方面发现了众多的变异材料，为相关研究提供了丰富的种质资源[25-26]。

注：左上 叶形突变体[20]；右上 种皮不完整突变体[23]；左下 早熟高产突变体[24]；右下 种皮颜色突变体[24]。Note:Top left: Leaf shape mutant;Top right: Incomplete seed coat mutant;Lower left:Earlier maturity,high yield mutant; Lower right: Seed-coat color change mutant.图1 部分大豆突变体与其原始品种不同的农艺性状比较[20,23-24]Fig.1 Comparisons of different agronomic traits between soybean mutant cultivars and their original cultivars[20,23-24]

2.2 生理水平的变化

在生理生化方面，辐射会打破植物体内自由基产生和清除的动态平衡，导致自由基增多，进而引发植物体内抗氧化酶系、激素及微量元素等一系列复杂的反应[27]。不同品种以及不同辐射处理的生理变化规律不尽相同。在燕麦[28]、普那菊[29]、甜高粱[30]、小麦[31-32]及烟草[33]等作物中的相关研究均表明，随着辐射剂量的增加，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)等酶活性均有所升高，但当辐射剂量增加到一定数值后会出现降低的情况，这可能是由于辐射对植物造成的损伤过大，植物无法进行自身修复的缘故。

有关大豆这方面的研究并不是很多。Alikamanoglu等研究表明，随着辐射剂量的增加，大豆植株的Fe、Cu、Zn、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)的含量逐渐增加，SOD和POD的活性明显升高[34]。Tewari等设置250 Gy、500 Gy和1 000 Gy 3个γ射线辐射剂量，辐射4个不同种皮颜色的大豆品种，发现黑色种皮的大豆对γ射线辐射较为敏感，豆腥味也因辐射得到了明显的改善，但是，SOD和CAT等酶活性却随着辐射剂量的升高而降低[35]，这与Alikamanoglu的研究结果不一致，这可能是因为辐射剂量率或者品种不同造成的。Moussa研究表明，在播种前用较低剂量(20 Gy，0.54 Gy·min-1)的γ射线辐射大豆种子，可以提高植物的抗旱性，且不论在干旱还是在水分充足的条件下，经过辐射处理的种子的植株其MDA含量和SOD、POD和CAT等酶活性均有所升高[36]。这些生理指标反应了植物体内由于辐射诱变造成损伤的程度，或许可以在将来的研究中作为最佳辐射剂量的筛选依据。

2.3 分子水平的变化

在分子水平方面，辐射可以引起DNA发生多种类型的损伤，包括碱基与核糖变化，链断裂和与蛋白质发生交联等。最常见的是DNA链的断裂，而链的断裂与诱变源的传能线密度(LET)密切相关。一般来说，随着LET的增大，单链断裂(SSB)减少，双链断裂(DSB)增多[37]。而为了保持遗传的稳定性，生物体内普遍存在着DNA的损伤修复机制，以消除或减轻DNA的损伤[38]。所以，育种中理想的诱变源，应该既可以使DNA分子发生多种类型的损伤，又可以保证相对较低的被修复率。辐射诱变所获得的突变体，一方面可以作为优质的种质资源，另一方面也可以作为大豆相关基因功能研究的原始材料。

大豆是由古四倍体演化而来的二倍体作物[39]，大豆基因组已于2010年在Nature杂志上正式发表公布[40]，利用大豆的基因组信息，已经成功克隆了调控大豆生育期、生长习性、种子形态和组分、结瘤和养分利用效率、生物以及非生物胁迫抗性等重要农艺性状的功能基因，也初步揭示了相关的作用机理[41]。这些研究，为充分利用辐射诱变进一步挖掘相关的QTL和基因功能网络在大豆产量和品质形成中的作用提供了基础证据，也为辐射诱变精确鉴定突变体和精准培育目标性状品种，奠定了分子基础。

3 大豆辐射诱变后代选育方法研究

大豆辐射诱变育种中最常用的处理材料是种子，通常选择半致死剂量。也有相关研究认为，致死率应该更低，这样更有利于自交后代的繁殖[11]。研究认为，针对不同的目标性状应选择不同的辐射处理方式和处理剂量。Tanhindarto等研究表明，较低剂量率的照射更有利于大豆异黄酮性状的改良[42]。Patil等研究发现，高剂量的γ射线和较高浓度的EMS复合诱变处理更有利于大豆脂肪酸性状的改良[43]。对于最佳辐射剂量的确定方法，由于不同品种对不同的辐射诱变源的响应存在很大差异，一直没有明确的标准。辐射剂量过高会导致处理当代植株的大量死亡，辐射剂量过低又不利于变异的产生。李多芳等建立了电离辐射致植物诱变效应的损伤-修复模型，该研究表明，电离辐射植物存活率-剂量呈马鞍型曲线关系，并且对于电离辐射植物诱变效应而言，可能存在多个最适剂量[44]。

因为辐射后代的有益突变率极低，而且要同时考虑育种需求并受到试验规模的限制，因此一次处理种子的量应该在500～2 000粒左右[45]。针对不同的样本数量和不同的育种需求，后代选育的方法也有所不同。谷秀芝等认为，系谱法稳定较快，一荚传法和摘优株荚法相对节省人力物力[46]。Patil等设置了19个辐射处理，共计19 000粒种子，采取M1代每株收5粒，并对M1代的收获物按照组合进行脂肪酸组成的初步鉴定，保留有明显变异的处理进行种植，M3代、M4代每株收获10粒进行性状是否稳定遗传的鉴定，最后筛选出高亚油酸、低亚麻油酸且其他品质性状不受影响的突变体[43]。这种筛选方法可能在M1代丢失部分目标性状，但对于样本数量过大且育种目标性状明确的情况，此种方法具有很好的借鉴意义。对于目标性状不明确的情况，可以参考尚娜[47]的研究方法，即在M1代不加选择，单株收获；在M2代种植成株行，田间观察，并按照一定的标准对突变体进行明确分类；M3代按分类进行小区种植，筛选表型稳定一致的突变体，进行分子标记，从分子水平对突变体进行鉴定，并进行后续的基因功能分析鉴定和突变体的扩繁推广等工作。此种方法最大程度的保留了可能的变异，并减少了筛选过程的工作量，但明确的分类标准的确定是本方法的一个难点。Arase等在M1代对最佳辐射剂量进行初步筛选，认为12C重离子辐射的条件下，剂量率320-MeV、2.5～5.0 Gy的辐射范围，既可以产生有效的变异又可以保证群体的存活数量，适合进行大豆诱变育种和突变体基因功能鉴定的相关研究，并利用此条件筛选出了叶绿素缺失突变体[48]。此种方法需要首先明确最适的辐射范围，方可有效地减少后代选择的工作量。

4 大豆辐射诱变后代主要突变类型

我国作物种质资源库中现存大豆种质资源2.3万余份,是世界上收集和保存大豆种质资源数量最多的国家[49]。这些种质资源具有多种类型的变异，其中百粒重的变异在1.8～46.0 g之间；品质方面，蛋白质的变异在29.3%～52.9%，其中含硫氨基酸的含量在2.0%～4.3%之间，脂肪的变异在10.7%～25.3%之间，其中亚麻酸的含量在4.2%～17.7%之间。除此之外，还筛选出对孢囊线虫病和锈病的抗性性状，同时也筛选出很多耐盐、耐冷和抗旱等一些高抗高耐的种质资源。

4.1 品质方面的变异

蛋白质和脂肪含量的多少是衡量大豆品质好坏的关键。大豆蛋白是一种含有8种人体必需的氨基酸的优质蛋白，但是含硫氨基酸的含量却较低；大豆脂肪最主要的营养成分是油酸和亚油酸，其中高度不饱和亚麻酸的存在，导致大豆油的稳定性和耐贮性降低,严重影响豆奶的商品价值，并使豆制品易被氧化变质。而且研究显示，大豆中的蛋白质含量和脂肪含量呈负相关关系，因此，为了提高大豆的营养价值、加工品质及氧化稳定性，大豆品质育种的综合目标是选育含有较高含量的蛋白质、脂肪和硫氨基酸及低亚麻酸含量的大豆[50]。但是传统的育种方法很难选出多个指标均为优良的品种，而诱变育种就可以打破这种限制，弥补传统育种的不足。黑龙江省农业科学院大豆所利用60Coγ射线、X射线和热中子等进行诱变处理，结合有性杂交，选育出黑农4号等13个系列优质高产的大豆品种，其中，黑农32大豆品种蛋白质与脂肪总和超过64%[51]。李雪华对60Coγ射线辐射的12个品种的3 000多份M3代家系进行筛选，筛选出大豆高蛋白和低蛋白含量、高油分和低油分含量的家系各200份，并扩繁至M4代，发现M4代的蛋白质含量或油分含量，与对照和M3代相比较，差异均达到显著水平[52]。安徽农业大学采用Ne激光辐射，育成的安激 2号，具有高产、高蛋白质和高脂肪等优良性状，同时该品种还抗花叶病毒和孢囊线虫病，已经被大面积推广[12]。Bolon等建立了快中子诱变大豆突变体库，并发现在多代中表现出种子蛋白质和脂肪含量显著增加或减少的突变体，蛋白质和脂肪的总含量在53.8%～65.8%之间[53]。

4.2 产量性状的变异

产量是育种中最重要的性状，但是产量是一个极其复杂的数量性状，一般育种中选择与产量相关的因子进行改良，如单株荚数、单株粒数及百粒重等，但也有研究认为大豆品种超高产性状主要与生物量、表观收获指数、生育期及花荚脱落等性状有关[54]。应用辐射诱变育种改善大豆产量性状的优势在于辐射诱变可以同时改良多个性状，达到优质高产的育种目标。翁秀英等早在1966年就用X射线照射满金仓的后代，获得了一系列优质高产且具有不同适应性的品种[55]。鹿文成等利用杂交育种和辐射诱变育种相结合的方法，选育出比对照增产8.5%的黑河52，该品种还同时具有早熟、秆强及不炸荚等优良性状[56]。韩国育种者Lee等在γ射线250 Gy辐照的条件下，选育出Bangsakong和Josaengseori两个高产品种，相比原品种分别增产15%和142%，但是百粒重却反而降低[24]。Meng等以激光为诱变源，将培育的大豆品种单产提高了30%[57]。由以上研究成果可以看出，辐射诱变育种技术可以在大豆产量性状改良方面获得较好的效果，但是目前只能结合一些明显的与产量相关的表型性状进行选择，如何能更有效地在早期世代选择出高产的突变是一个难点。

4.3 抗性性状的变异

抗性包括抗病和抗逆(寒、旱、盐、碱等)。抗病突变是最难诱发的突变类型，一方面，抗病性状的变异率极低，例如，γ射线诱变得到的大豆抗锈病突变率仅为8.3×10-6[58]；另一方面，抗病性状的筛选过程工作量大，且操作困难，而且出现嵌合体的概率高，后代分离时间较长，很难形成稳定的突变体[59]。所以，在大豆抗病性状改良的研究中，通常采用辐射诱变技术和杂交育种技术相结合的方法，并已经育成了同时抗灰斑病和病毒病的大豆品种合丰33号[60]、抗灰斑病的牡丰6号[61]及抗花叶病毒的诱变30[62]等。在抗逆性方面，一般在大田实验中，抗逆性的筛选方法和评价指标很难有明确的标准，很多时候需要人为的创造相关的逆境条件，且辐射诱变育种需要逐代扩繁，这也给筛选和鉴定的工作带来很大的难度，尚没有通过辐射诱变育种育成相关抗逆性的品种的报道。理论上讲，辐射诱变应该在创制抗逆大豆种质突变体和抗逆品种的选育过程中，起到了促进作用，然而，目前尚无相关的研究证据。

5 辐射诱变育种需要加强的几个方面

5.1 辐射损伤机理的研究

辐射和寒害、旱害、低温及高温等一样也可以称之为是一种逆境，虽然研究表明辐射同其他众多逆境条件一样在M1代会引起关键酶(SOD、POD和CAT等)、激素和代谢产物(MDA等)的规律性变化，但是辐射损伤引起这些变化的具体调节机制尚不明确。同时，多项研究表明，大豆中的异黄酮皂苷等物质因具有抗氧化和抗自由基的功能，因而可能具有抗辐射效应[63]。那么大豆对于辐射的响应是否会因为这两种辐射防护物质的存在而不同于其他的植物，都有待于深入探讨。

5.2 重离子诱变剂的利用及其作用机理

重离子作为一种新型的诱变源，相对于其他诱变源具有更高的LET和更高的相对生物学效应(Relative Biological Effectiveness，简称RBE)，可以主要引发单链断裂、双链断裂等多种类型的变异，且被修复率很低，因而可以获得较高的突变率和较宽的突变谱[64]，在国内外很多植物育种中都有应用和研究[65]。然而，重离子在大豆辐射育种中的应用研究较少，尚没有通过重离子育成大豆品种的相关报道。张秋英等研究认为，重离子辐射辐射剂量应以100 Gy以下为宜[15]；余丽霞等通过重离子辐射，发现了可以在M2代稳定遗传的褐皮突变体[14]。无疑，这些开创性的工作为重离子辐射在大豆育种中的应用奠定了基础，而深入解析适宜剂量以及由此产生的表型变化的生理分子机制，将为作物辐射育种增加新的知识，并有助于加快重离子辐射培育大豆新品种的进程。

5.3 空间诱变育种机理

我国于1978年开始航天育种，目前已经取得了阶段性进展，已有4个大豆品种已经通过了国家级或省级审定，其中克山1号为早熟高油品种，金源为早熟高蛋白品种[66]。但是，目前关于空间诱变育种技术的原理和方法等尚不完善。比如，如何选择诱变材料，如何保留隐性突变材料，确保突变系群的完整性以进行后代的筛选？而且，空间诱变后代性状突变效应的遗传研究尚处于探索阶段[67]。这些问题的解决和遗传变异机理的揭示，将有助于更好地发掘优良变异，提高有益变异的利用率，进而推动其在大豆育种中的应用。

5.4 与其他育种方法的结合

近年来，分子育种技术及基因编辑育种技术蓬勃发展，很大程度地改善了育种中的盲目性。辐射诱变育种因其可以提供新的变异类型，仍具有其他育种技术无法替代的优势，所以仍是大豆育种中一种必不可少的方法。但是育种工作者应注重将辐射诱变育种、杂交育种和分子育种进行更好地结合，这样一方面可以更好地发挥辐射诱变育种的优势，另一方面，也可以更高效地进行突变体的筛选，有效减少突变体筛选过程中的人力物力，并且可以发现一些肉眼不易鉴别的突变体。