2型马凡综合征TGFBR2基因新致病突变研究

张琳 张莹 范鹏 杨坤璂 周宪梁

100037 北京，中国医学科学院 阜外医院高血压诊治中心

马凡综合征(Marfan syndrome，MFS)是遗传结缔组织疾病，2型MFS(type 2 Marfan syndrome，MFS2)患者携带转化生长因子β受体2基因(transforming growth factor beta receptor Ⅱ gene，TGFBR2)突变[1]。本研究报道了2个中国MFS2家系的临床特征和致病基因筛查结果，探讨TGFBR2跨膜结构域基因突变与MFS2临床表型的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

纳入中国医学科学院阜外医院门诊收治的患有2型马凡综合征的先证者和其所有家系成员，并纳入100名无血缘关系的健康人作为对照。所有研究对象均为汉族。本研究符合“赫尔辛基宣言”，经医院伦理委员会批准(伦理批号：3332016017)，所有研究对象均签署知情同意书，其个人信息均经严格保密。

研究对象的家系图见图1。对照组成员均排除MFS及其他结缔组织相关疾病。

图1 先证者家系图(箭头所示为先证者)

1.2 基因突变分析

收集研究对象的外周静脉血，使用基因组DNA提取试剂盒(Qiagen Inc.，Germantown，MD)提取基因组DNA。使用Oligo 6.0软件设计合成65个原纤维蛋白1基因(fibrillin-1 gene，FBN1)外显子、7个TGFBR2外显子的PCR引物[2-3]，TGFBR2的PCR引物序列和产物长度参见表1。通过聚合酶链式反应分别扩增FBN1和TGFBR2的外显子及两侧剪接体结合区域。使用ABI3730xl 测序仪对PCR产物进行测序。

1.3 突变分析

序列比对使用NCBI的BLAST功能(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和UCSC的BLAT search功能(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)。TGFBR2的cDNA序列来自GenBank：NM_003242.5(www.hgvs.org/mutnomen)，规定起始密码子ATG的碱基A是+1位。将PCR扩增产物的测序结果与Genebank中的TGFBR2基因cDNA参考序列进行比对，同时阅读基因序列图谱，寻找可能的致病突变。对可能的致病突变与NCBI的SNP功能(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)中的TGFBR2单核苷酸多态性对比分析，排除健康人群中存在的单核苷酸多态位点。为明确所发现的突变是否为未知的人群多态位点，对100名对照人群进行了该片段的基因扩增测序。同时查找MFS致病基因突变数据库(http：//www.umd.be)和文献，确定测序得到的致病突变是否曾报道过。先证者及所有成员均同时进行了FBN1基因65个外显子的测序以排除携带FBN1基因突变。

表1 TGFBR2基因外显子引物

注：TGFBR2：转化生长因子β受体2基因；引物序列是从5’→ 3’方向

1.4 预测TGFBR2基因突变所造成的影响

使用SWISS-MODEL工具(http：//swissmodel.expasy.org/)根据TGFBR2蛋白的参考序列(NP_003233.4)建立正常TGFBR2蛋白3D模型，并根据测序结果对正常模型进行定点突变，得到TGFBR2基因突变后的异常TGFBR2蛋白3D模型(图2)。预测分析TGFBR2基因突变对蛋白结构可能造成的影响[4]。

1.5 基因型-表型分析

根据TGFBR2基因突变和3D模型，我们使用“TGFBR2 mutation”匹配“phenotype”为关键词在PubMed 数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和Embase数据库(http：//www.embase.com/)检索了TGFBR2错义突变携带者的基因型和表型数据并进行基因型-表型分析。

2 结果

2.1 先证者和家系成员的临床表型

先证者和所有家系成员的临床症状和检查结果见表2。根据诊断标准和家族遗传史，两个家系的先证者均可确诊为MFS2[5]。其中，家系1的先证者(F1-Ⅱ：1)为42岁女性，因胸部撕裂样疼痛就诊于我院急诊，行主动脉CT检查发现升主动脉夹层及主动脉根部扩张(直径48 mm)，进行了急诊主动脉根部及升主动脉替换术。

家系2先证者(F2-Ⅲ：1)为18岁男性，因超声心动图示主动脉根部扩张就诊，CT示主动脉根部直径为52 mm，行主动脉根部替换术。对照组人群的检查未发现阳性的MFS相关体征。

根据以往研究报道[6-7]，两个家系的先证者(F1-Ⅱ：1、F2-Ⅲ：1)术后均使用了氯沙坦(50 mg/d)控制主动脉扩张及相关的心血管系统病理改变。随访1年发现，经氯沙坦治疗后2名先证者均未出现进一步的主动脉病变。其他携带TGFBR2基因突变的且有心血管系统临床表型的家系成员(F1-Ⅰ：2、F1-Ⅱ：2、F1-Ⅲ：1、F2-Ⅱ：1、F2-Ⅱ：2和F2-Ⅲ：2)也使用了氯沙坦(50 mg/d)治疗。经氯沙坦干预后，所有成员主动脉根部扩张均无明显进展。

2.2 基因突变分析

家系1的先证者(F1-Ⅱ：1)、先证者母亲(F1-Ⅰ：2)、先证者弟弟(F1-Ⅱ：2)和先证者儿子(F1-Ⅲ：1)均携带了1个以往未曾报道的新TGFBR2基因错义突变p.I37K，c.110T>A。这个突变位于TGFBR2的第2个外显子，第110位的碱基由胸腺嘧啶(Thymine，T)突变成腺嘌呤(Adenine，A)，使编码蛋白质的第37位氨基酸由异亮氨酸(isoleucine，I)变为了赖氨酸(lysine，K)。

表2 先证者及其家系成员的临床表型

注：F2-Ⅰ：1由于在43岁时猝死，未能做临床检查和基因检测

家系2的先证者(F2-Ⅲ：1)、先证者父亲(F2-Ⅱ：1)、先证者叔叔(F2-Ⅱ：2)和先证者的表妹(F2-Ⅲ：2)均携带了1个以往未曾报道的TGFBR2基因错义突变p.G43D，c.128G>A。这个突变位于TGFBR2的第2个外显子，第128位的碱基由鸟嘌呤(Guanine，G)突变成腺嘌呤(Adenine，A)，使编码蛋白质的第43位氨基酸由甘氨酸(Glycine，G)变为了天冬氨酸(Aspartic acid，D)。

此2个新发现的基因突变均位于TGFBR2的跨膜结构域，此区域为高度保守核苷酸区域。100名汉族对照人群未发现携带这些突变。所有研究对象均无FBN1基因突变。基因测序结果见图3。

2.3 TGFBR2基因突变对蛋白结构影响

家系1、2携带的致病突变均位于TGFBR2的跨膜结构域。此结构域是一个高度保守的核苷酸区域，对TGFBR2功能的维持有重要作用。对TGFBR2基因突变后的异常TGFBR2蛋白3D模型分析显示，由于TGFBR2基因的碱基变化，改变了mRNA的密码子编码，转录的TGFBR2的氨基酸发生了改变。由于氨基酸极性、亲疏水性和电势能的改变，改变了蛋白质构象。这种结构上的显著改变可能会干扰TGFBR2蛋白跨膜结构域的构象，继而影响TGFBR2与TGF-β通路其他配体的结合或活化，损害TGF-β通路的功能。

2.4 TGFBR2基因跨膜结构域错义突变携带者的基因型-表型分析

经过文献搜索及数据库检索，这是第1次发现MFS2患者携带的致病突变位于TGFBR2基因跨膜结构域，目前此结构域致病突变的基因型-表型联系不明。因此，我们对2个家系所有的8名TGFBR2跨膜结构域突变的携带者进行了基因型表型分析。所有TGFBR2基因跨膜结构域错义突变携带者(100%，8/8)均符合主要诊断标准的心血管系统累及，出现了升主动脉扩张、主动脉根部扩张、主动脉夹层等严重的心血管系统临床表型。75%(6/8)的携带者有骨骼系统的异常累及，其中只有12.5%(1/8)符合主要诊断标准。没有TGFBR2基因突变携带者有眼部累及。

图3 先证者及健康对照的测序图(箭头所示为突变处)

3 讨论

典型的MFS可累及骨骼、眼部和心血管等多个系统。MFS患者心血管系统常见进展性的升主动脉扩张、升主动脉夹层[5]。主动脉瘤及主动脉夹层进展迅速时引起动脉破裂是MFS患者最主要的死亡原因[5-8]。

MFS最常见的致病基因为FBN1[9]。近来研究发现，部分MFS样患者携带TGFBR2基因突变，这一型综合征被命名为MFS2(OMIM#154705)[10]。Mizuguchi等[11]对MFS2患者进行遗传基因分析发现，TGFBR2基因致病突变可与MFS2临床表型相关。

转化生长因子超家族信号通路对维持细胞外基质和组织稳态起着重要的作用[12]。TGFBR2是这个基因家族的重要成员，编码的跨膜蛋白激酶受体参与转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)家族的信号转导[13]。TGFBR2基因由7个外显子编码的567个氨基酸组成，包括N末端配体结合结构域、跨膜结构域和活性C末端丝/苏氨酸激酶结构域。这些结构在TGF-β信号转导中发挥着重要作用，是细胞外结缔组织维持正常功能的关键环节[13]。TGFBR2基因突变与血管畸形病变有关[14]，这些突变大部分位于活性C末端丝/苏氨酸激酶结构域的错义替换或无义突变，干扰了其结构完整性，影响了蛋白的功能。目前对于跨膜结构域突变报道较少，未发现MFS2患者携带TGFBR2跨膜结构域的致病突变。

错误的TGF-β细胞通路信号会导致结缔组织基质的原纤维蛋白排列杂乱和降解，出现MFS等异常表型[5]。TGF-β的细胞信号由两种类型的跨膜受体——Ⅰ型跨膜受体(TbRⅠ)和Ⅱ型跨膜受体(TbRⅡ)转导进入细胞。TbRⅠ和TbRⅡ分别由TGFBR1和TGFBR2基因编码[15]。TGFBR2基因突变可能会导致TbRⅡ功能的丧失，引起MFS2、Loeys-Dietz Syndrome和2型家族性胸主动脉夹层动脉瘤(type 2 thoracic aortic aneurysms and dissections)[5]。

本研究对FBN1和TGFBR2的编码区进行直接测序，发现了2个新的TGFBR2基因突变p.I37K(c.110T>A)和p.G43D(c.128G>A)。I37K突变和G43D突变均位于TbRⅡ一个高度保守的跨膜结构域，与底物基质结合直接相关。跨膜结构域的基因突变会损害TGFBR2蛋白的底物结合和信号传导。本研究发现的I37K突变和G43D突变使氨基酸的亲疏水性和极性均发生了改变，影响了跨膜结构域的功能，使TGFBR2蛋白的结构和功能受损。干扰TGF-β的信号转导通路，最终表现为突变携带者的MFS2表型，进一步验证了TGFBR2突变与MFS2的关系。

本研究第1次报道TGFBR2基因跨膜结构域的致病突变，对其携带者的基因型表型研究具有重大意义。I37K和G43D基因突变携带者心血管系统表型符合主要诊断标准的比例非常高(100%，8/8)。近来研究发现，血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂——氯沙坦(losartan)能抑制TGF-β介导的细胞外信号调节激酶激活，进而延缓甚至逆转主动脉扩张等病变的进展[6]。因此，氯沙坦可应用于治疗MFS2患者。本研究中使用了氯沙坦干预TGFBR2突变携带者，所有使用氯沙坦治疗的患者随访期间主动脉病变均未出现明显进展。

本研究报道了MFS2的家系先证者及其他成员的致病突变基因型和临床表型，发现了2个新的TGFBR2基因跨膜结构域突变p.I37K(c.110T>A)和p.G43D(c.128G>A)。携带TGFBR2跨膜结构域致病突变的患者更容易出现严重的心血管事件，氯沙坦治疗可以延缓主动脉病变的进展。这些发现对MFS2以及其他TGF-β通路相关疾病的基因检查、诊断和治疗有重要意义。

利益冲突：无