Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪HBV—DNA检测系统的性能验证

王娇 钱军 石英 蔡旺喜 刘光忠

[摘要] 目的 驗证Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪HBV-DNA检测系统的性能，确定该系统是否稳定可靠，是否满足临床需求。 方法 参考美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的EP系列文件及中国合格评定国家认可委员会（CNAS）对实验室检测系统评估的要求，对Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪进行性能评价，主要从以下几个方面进行：精密度、正确度、线性、测量和/或可报告范围及抗干扰能力等。结果Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪HBV-DNA检测系统的批内精密度（批内CV）分别为5.21%（低浓度）、3.40%（高浓度）；批间精密度（批间CV）为3.45%（中值），1.39%（高值）；准确度评估以参加能力验证/室间质评的项目来判断，项目PT成绩为100%，通过；线性回归方程是Y = 1.010X +0.004，R2 = 0.991线性范围为5.00×102～2.84×108 U/mL；临床可报告范围为103～108 U/mL；抗干扰能力评估：检测5个样品中至少个样品测量结果与分析物预期浓度偏倚<±7.5%。 结论 Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪HBV-DNA检测系统具有良好的精密度、准确度、线性范围、临床可报告范围、抗干扰能力，可用于临床标本检测。

[关键词] HBV-DNA；检测系统；性能验证

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（c）-0065-04

Performance verification of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA detection system

WANG Jiao1，2 QIAN Jun1，2 SHI Ying1，2 CAI Wangxi1，2 LIU Guangzhong1，2▲

1.Department of Clinical Laboratory， Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan 430074， China； 2.Hubei Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan 430074， China

[Abstract] Objective To verify the performance of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA detection system， in order to confirm its stability， accuracy and reliability. Methods According to the EP series of document issued by the National Committee for Clinical Laboratory Standards （NCCLS） and requirements for the assessment of laboratory testing systems issued by China National Accreditation Service for Conformity Assessment （CNAS）， the precision， accuracy， linear， measurement and/or reportable range and anti-interference ability of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR were performed and evaluated. Results The within-batch precision CV of low value and high value of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA testing system was 5.21% and 3.40%，respectively， and the between-batch precision CV of middle value and high value was 3.45% and 1.39% respectively. The correctness was valuated by participating in verification of room to judge the qualitative evaluation of the project and PT result was 100%. The linear regression equation was Y = 1.010X +0.004， R2 = 0.991. The linearity range was 5.00×102 - 2.84×108 U/mL， the clinical reportable range was 103 - 108 U/mL； five samples was tested to assess the anti-interference capability， four sample measurement results according to the concentration of expected bias was < ±7.5%. Conclusion The performance of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA testing system conforms to the requirements in precision， accuracy， linear range， clinical reportable range， anti-interference ability and can be applied to the clinical detection.

[Key words] HBV-DNA； Detection system； Performance verification

湖北省中医院（以下简称“我院”）光谷分院新增分子生物学实验室，购置一台美国安捷伦Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪。GB/T22576-2008明确指出，临床实验室使用厂家已严格评估的检验方法或试剂盒之前，应验证相关分析性能以证实在本实验室能达到厂家声明的性能指标[1]。CNAS-CL36中5.5.1.2要求定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少应包括正确度、精密度、线性、测量和/或可报告范围、抗干扰能力等[2]。本文依据ISO15189[3]和原卫生部《医疗机构临床实验室管理办法》的相关文件[4]，根据HBV-DNA试剂盒产品性能要求，对本实验室新购置的Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪HBV-DNA检测系统进行性能验证。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标准品为武汉百泰基因工程有限公司生产乙肝试剂盒配套标准品（批号：20160801），质控品由北京康彻斯坦生物技术有限公司提供，标本分别为原国家卫生计生委临检中心室间评价样本，湖北省临检中心室间评价样本，我院花园山院区患者检测的样本。

1.2 仪器与试剂

Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪（美国安捷伦公司）、生物安全柜、高速离心机、恒温金属浴等；武汉百泰基因工程有限公司生产乙型肝炎DNA定量检测试剂盒，批号：20160801 。

1.3 方法

1.3.1 精密度的评价

每次应进行正常的室内质量控制[5]，在控后方可进行精密度的评价。

1.3.1.1 重复精密度（批内精密度） 选择具有医学决定水平的高低值标本在相当短的时间内，按规定的操作方法，在较短时间内及稳定的条件下各作20次重复测定[6-7]。计算其均值、标准差与变异系数。标本为患者血清。

1.3.1.2 中间精密度（批间精密度） 选择室内质控作为衡量中间精密度的依据。选取2个月的质控数据（浓度为中值和高值质控品）计算均值、标准差与变异系数。

1.3.2 正确度的评价

对卫生部临检中心和湖北省临检中心提供的室间质评样本进行检测，检测结果与已知的 靶值和可接受限进行比对。项目PT成绩≥80%，则判定通过。

1.3.3 线性范围的评价

参照EP6-A文件[8]，用阴性血清将1.00×108浓度患者血清梯度稀释成7份样本，浓度分别为 1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105、1.00×104、1.00×103、1.00×102 U/mL（比厂方声明的线性范围低1个数量级），全部检测应在同一工作日内完成。每个浓度样本重复测定3次，记录测定结果，计算线性相关系数和线性范围。

1.3.4 临床可报告范围的评价

荧光定量PCR法HBV-DNA检测试剂盒说明书中显示本检测系统的线性范围分别为5.00×102～1.00×108 U/mL。该肝炎系列核酸检测分别大于1.00×108 U/mL或1.00×107 U/mL浓度已属临床高载量患者，符合抗病毒治疗指标，不必对更高的载量进行精确检测，若分别小于5.00×102 U/mL或1.00×103 U/mL已为临床疗效监测效果较好的指标，此群患者对抗病毒治疗不敏感，因此對疗效监测意义不大。因此，当肝炎系列核酸检测线性范围足够宽时，其范围即可成为其临床可报告范围。

1.3.5 抗干扰能力的评价

在不同分析物浓度血浆用高胆红素（总胆红素215 μmol/L）阴性血清，高血脂（三酰甘油10.5 mmol/L）阴性血清1∶1稀释后同一时间进行检测分析（血浆标本及稀释所用血清均来自通过ISO15189的湖北省中医院花园山院区），分别检测5个样品，至少4个样品测量结果与分析物预期浓度偏倚<±7.5%[2]。（参考CNAS-CL36：《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》中分子诊断项目分析性能标准）。

1.4 评价标准

所有HBV-DNA浓度数据先进行以10为底的对数转换，然后进行统计学计算，计算其均值、标准差与变异系数。

1.4.1 精密度的评价标准

检测所有数据超出2 SD的数据不能超过2个，否则应分析失控原因纠正后重新进行试验。评价标准以CLIA′88规定作为允许总误差（TEa）[9]。批内精密度CV%应小于1/4总允许误差（TEa）。批间精密度CV%应小于1/3总允许误差（TEa）。如果批内精密度、批间精密度小于允许范围的，验证通过。如果批内精密度、批间精密度大于验证值，精密度验证未通过，重新验证或与厂家联系重新校准仪器。

1.4.2 正确度的评价标准

通过检测有证参考物质，依据偏倚计算正确度。无有证参考物质时，通过参加能力验证/室间质评来进行正确度验证，依据偏倚计算正确度[10]。

1.4.3 线性范围评价标准

依照CLSI的EP6-A文件的要求[11]，所有样品应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成。剔除离群值，单个离群值可直接由数据组中剔除并进行重测，全部样本无需重新测定。如发现多个离群值或数据点过于分散，需检查造成此误差的可能原因，对可能原因进行纠正后，对全部样本进行重新测定。求出2次测定结果的平均值和每一稀释度的预期值。

采用多项式回归作为分析线性的评价方法，以实测均值为X，以预期值为Y，在初步判断无离群值后，使用Excel软件进行二元一次、二元二次和二元三次多项式的回归分析。选择最小标准误差的拟合曲线为最适模型。计算最适模型在每个浓度处的预期值，其与线性模型的偏离（Dli）应小于1/2 TEa。判断标准：

1.4.3.1 线性1，数据拟合的最佳形式为直线，所有数据几乎均落在一条直线上，且数据的精密度较高。该范围为线性范围。

1.4.3.2 线性2，数据拟合的最佳形式为非直线，但数据均在的可接受范围内，数据拟合非线性无临床意义。该范围为线性范围。

1.4.3.3 非线性，数据拟合的最佳形式为非直线，且数据超过了线性的可接受范围，并可能有临床意义。

1.4.3.4不精密，每份样本的重复性差，数据有较大变异，导致统计学功效降低，不能用于评价线性。

如果判断结果为非线性，则舍去最高点或最低点数据，另做回归分析统计，直至出现线性1或线性2。如果判断结果为不精密，则需查看检测数据，判断不精密的原因，并进行纠正。

1.4.4 临床可报告范围评价标准

当肝炎系列核酸检测线性范围足够宽时，其范围即可成为其临床可报告范围。

1.4.5 抗干扰能力评价标准

检测5个样品，至少4个样品测量结果与分析物预期浓度偏倚<±7.5%。

2 结果

2.1 HBV-DNA精密度评估结果

精密度性能验证结果详见表1、2。HBV-DNA低值和高值的批内CV分别为5.21%（低浓度）、3.40%（高浓度）和中值的批间CV为3.45%（批间），小于厂家声明的10%，CV 批内和CV批间均符合厂家声明。同时也满足批内精密度CV%小于1/4总允许误差（TEa）（1/4×0.4=0.1），批间精密度CV%小于1/3总允许误差（TEa）（1/3×0.4=0.13）。

表1 HBV-DNA批内精密度评估结果

表2 HBV-DNA批间精密度评估结果

2.2 HBV-DNA正确度的评价结果

参加2016年卫计委室间质评和湖北省临检中心室间质评，PT成绩100%，验证通过 。

2.3 线性范围验证结果

本研究检测的高浓度患者标本为2.32×108（血清来自通过ISO15189认可的湖北省中医院花园山院区检验科），对其连续10倍稀释来进行线性范围的验证，得到的线性范围是5.00×102～2.84×108 U/mL，在厂家声明的5×102～1×108 U/mL范围内。见图1 。

线性范围为5.00×102～2.84×108 U/mL，P < 0.05

图1 线性范围验证回归曲线

2.4 临床可报告范围的评估

荧光定量PCR法HBVDNA检测试剂盒说明书中显示本检测系统的线性范围分别为5.00×102～1.00×108 U/mL。而本实验的线性范围验证可检测5.00×102～2.84×108 U/mL，该范围足够大，103～108 U/mL可为其的临床可报告范围。

2.5 抗干扰能力评估

在5个不同分析物浓度血浆中加入不同干扰物（胆红素、三酰甘油）后进行检测分析，分别检测5个样品，至少4个样品测量结果与分析物预期浓度偏倚<±7.5%（标准参考CNAS-CL36：《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》附录A）。检测结果见表3。

3 讨论

检测系统或方法学的分析性能评价是保证临床检验质量的重要内容。ISO15189是国际 医学界普遍承认并遵照执行的关于医学实验室质量和能力方面要求的国际标准[12]。临床实验室在引入新的检测系统或检测方法时，多数厂家均提供了较为完整的性能参数，但需验证其性能[13]。在临床检验工作中，如果均由生产商进行实验室各新仪器验收校准以及定期校准，其校准结果具有局限性，可信性较差[14-16]。本实验所有患者标本来源于我院花园山院区，我院花園山院区于2013年通过ISO15189实验室认可，血清标本质量可靠，对比性可信。本文依照依据CNAS-CL02：《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）对医学实验室检测系统性能评价的相关要求以及CNAS-CL36：《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》，对我院光谷分院新购置的Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪进行性能评价，从精密度、准确度、线性范围、临床可报告范围、抗干扰因素等方面对Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪进行验证。

精密度的检测反映检测结果的重复性，本实验数据中，HBV-DNA低值和高值的批内CV分别为5.21%、3.40%，批间CV为3.45%，小于厂家声明的10%。准确度是评价仪器测量结果与真值的一致程度。一种方案是通过检测有证参考物质，依据偏倚计算正确度。另一种是无有证参考物质时，通过参加能力验证/室间质评来进行正确度验证，依据偏倚计算正确度[10]。本次实验采用第二种方案，即采用国家卫生部临检中心和湖北省临检中心发放的室间质评物作为标准物质，检测了2016年全国室间质评的5个阳性标本，湖北省临检中心室间质评5个标本，结果全部通过，PT成绩100%。线性范围指标本不需要任何预处理可以检测出待测物的浓度范围，用于线性范围验证的标本应尽覆盖整个线性范围[11]。厂家声明的线性范围为5×102～1×108 U/mL，笔者收集通过ISO15189认可的医学实验室的高浓度标本进行稀释，检测线性范围为5.00×102～2.84×108 U/mL，在厂家声明的5×102～1×108 U/mL范围内。当肝炎系列核酸检测线性范围足够宽时，其范围即可成为其临床可报告范围。而本实验的线性范围验证可检测5.00×102～2.84×108 U/mL，该范围足够大，103～108 U/mL可为其的临床可报告范围。荧光定量PCR法HBV-DNA检测试剂盒说明书中显示本检测系统的线性范围分别为5×102～1×108 U/mL。该肝炎系列核酸检测分别大于1.00×108 U/mL或1.00×107 U/mL浓度已属临床高载量患者，符合抗病毒治疗指标，不必要对更高的载量进行精确检测，若分别小于5.00×102 U/mL或1.00×103 U/mL已为临床疗效监测效果较好的指标，此群患者对抗病毒治疗不敏感，因此对疗效监测意义不大。因此，当肝炎系列核酸检测线性范围足够宽时，其范围即可成为其临床可报告范围。临床上HBV-DNA检测时，可能的干扰因素多为黄疸或脂血，本文分别比较该两种可能的干扰因素对结果的影响，分别检测5个样品，至少4个样品测量结果与分析物预期浓度偏倚<±7.5%，表明抗干扰效果较好，可用于临床检测。

综上所述，依照依据CNAS-CL02：《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）对医学实验室检测系统性能评价的相关要求以及CNAS-CL36：《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》，对新购置的Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪进行性能评价，结果表明，新购置的Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪性能和厂家声明的一致，检测系统具有良好的精密度、准确度、线性范围、临床可报告范围、抗干扰能力等，符合CNAS-CL02：《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）的要求，能用于临床标本检测。

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（收稿日期：2018-02-28 本文編辑：苏 畅）