Krüppel样因子4抑制高糖刺激MES-13细胞炎症的机制

糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病(DM)的严重并发症之一，在每年新进展至ESRD的患者中，DKD所占比例逐年升高。炎症反应是DKD发病的重要机制之一，而白细胞介素(IL-6)、单核趋化蛋白1(MCP-1)是DKD炎症机制中的重要指标[1]。Krüppel样因子4(KLF4)又名胃肠富集KLF(gut-enriched Krüppel-like factor,GKLF)[2]，它可以调控IL-6[3]、MCP-1、iNOS[4]等因子表达，影响核因子κB(NF-κB)信号通路[5]，从而发挥抗炎或促炎作用。在肾脏炎症方面，KLF4可调控HK-2细胞中MIF、MCP-1的表达[6]，但KLF4在肾小球系膜细胞中是否有表达，以及它对高糖刺激的肾小球系膜细胞炎症是否同样具有调控作用，尚未见报道。因此，本研究拟采用体外培养肾小球系膜细胞模型，使用高糖刺激后，观察KLF4及炎症指标IL-6、MCP-1的表达变化，从而探讨DKD细胞模型中KLF4与炎症反应的关系。

DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰方式，它参与了体内多项生理病理过程，而5-氮杂胞苷(5-Azacytidine，5-Az)，是最常用的甲基化抑制剂。在糖尿病肾病中，DNA甲基化水平明显升高[7]，KLF4的表达水平与其转录子甲基化水平负相关，应用5-Az后，KLF4表达水平升高[8,9]，我们前期研究发现，应用5-Az后，可以上调转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的人HK-2细胞中KLF4表达[10]。因此，本研究中，我们拟采用5-Az抑制高糖刺激的肾小球系膜细胞的甲基化过程，观察KLF4及炎症指标IL-6、MCP-1的变化，从而进一步寻找KLF4调控DKD炎症反应的可能机制。为探寻DKD的发病机制，寻找DKD的潜在治疗靶点提供理论依据。

材料与方法

实验材料

小鼠肾小球系膜细胞(MES-13) 由ATCC提供。

主要仪器 实时荧光定量PCR仪：美国Applied Biosystems公司、Axygen、ABI；SDS PAGE凝胶电泳与转膜设备、化学发光成像系统：Bio - Rad公司；核酸定量仪NanoDrop Lite、细胞恒温培养箱：Thermo；凝胶成像系统5000 Plus：SAGECREATION。

主要试剂 羊抗兔IgG/HRP标记、羊抗鼠IgG/HRP标记：武汉博士德公司；Anti- KLF抗体：Abcam公司、proteintech公司；5-氮杂胞嘧啶核苷：Sigma；Anti-IL-6抗体、Anti-MCP-1抗体：Proteintech公司；Anti-GAPDH抗体：南京凯基公司；KLF4 引物、GAPDH 引物、IL-6 引物、MCP-1 引物：GeneCopoeia公司；mRNA逆转录试剂盒：Thermo；KOD -Plus- Neo：TOYOBO；QIAprep Spin Miniprep Kit：QIAGEN；Positive clone测序：生工生物工程(上海)有限公司。

实验方法

细胞培养 将MES-13细胞株复苏后，用含低糖(5.5 mmol/L D-葡萄糖)DMEM的25 cm2细胞培养瓶在恒温细胞培养箱(37℃，5% CO2)内进行培养。根据细胞生长状态，按1∶ 2～1∶ 4比例传代。

细胞分组

高糖处理不同时间点的MES-13细胞实验将细胞接种于六孔培养板或60 mm培养皿，使用低糖DMEM完全培养基培养培养，当细胞生长至融合程度约70%～80%后，更换细胞培养基为高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)DMEM完全培养基，分别于0h，6h，12h，24h，36h，48h，72h提取细胞内总蛋白，使用WB测KLF4蛋白表达，选取最佳刺激时间。

不同浓度5-Az干预高糖处理48h的MES-13细胞实验将细胞接种于六孔培养板或60 mm培养皿，使用低糖DMEM完全培养基培养，当细胞生长至融合程度约70%～80%后，更换细胞培养基，将实验分为低糖组，高渗组(30 mmol/L甘露醇)，高糖+不同浓度5-Az组(0.5 μmol/L，1 μmol/L,2 μmol/L,5 μmol/L)。培养48h，分别提取各组细胞总蛋白，使用Westen Blot检测各组KLF4、IL-6、MCP-1蛋白的表达，选取5-Az最佳干预浓度。

5-Az(5 μmol/L)干预高糖处理48h的MES-13细胞实验将细胞接种于六孔培养板或60 mm培养皿，以低糖DMEM完全培养基培养，当细胞生长至融合程度约70%～80%后更换细胞培养基，将实验分为低糖组、高渗组、高糖组，高糖+5-Az(5 μmol/L)组。培养48h分别提取各组细胞总RNA，使用Real-Time PCR检测KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表达。

慢病毒转染KLF4基因至MES-13细胞的细胞实验将质粒转入MES-13细胞中，细胞分为空白质粒组(Lv-NC)和KLF4基因组(Lv-KLF4)，细胞接种于六孔培养板或60 mm培养皿，以低糖DMEM完全培养基培养培养，当细胞生长至融合程度约70%～80%后，更换细胞培养基为高糖DMEM完全培养基，0h、48h时分别提取各组细胞总RNA，使用Real-Time PCR检测KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表达。

Western Blot 将各组MES-13细胞从细胞恒温培养箱中取出，弃旧完全培养基，用PBS溶液冲洗3次后，加入适量RIPA裂解液(强)及PMSF裂解细胞，提取细胞裂解液离心，留取上清液，测定目标样品蛋白浓度。将待测蛋白样品按每孔20～50 μg上样，然后进行电泳、转膜。封闭2h后，洗去封闭液，根据目的蛋白分子量，将PVDF膜裁成若干条带状小膜，将裁剪的PVDF膜分别放入已配好的含有不同目的蛋白一抗稀释液(KLF4、IL-6、MCP-1、GAPDH)的离心管中，4℃摇床上孵育过夜。洗脱一抗后，根据目的蛋白种属来源，使用目的蛋白抗体种属相对应的二抗孵育液孵育1～2h。洗脱二抗，加入ECL工作液至化学发光成像系统中进行显影。使用成像分析系统扫描分析发光结果，应用图像分析软件Image J进行目的蛋白和内参GAPDH吸光度分析。

Real-Time PCR 在GeneBank网站中查找小鼠KLF4、IL-6、MCP-1的基因序列，从GeneCopoeia订购KLF4、IL-6、MCP-1、GAPDH引物。KLF4引物：forward 5′-GAATTCATGAGGCAGCCACCTGGC-3′,reverse 5′-GGATCCTTAAAAATGCCTCTTCATGTG-3′;IL-6引物：forward 5′-CTGGGTACCGGATCCTGAGAGTGTGTTTT-3′,reverse 5’-GCAAGCTTGGAACTTCATAGCGGTTTCT-3’;MCP-1引物：forward 5′-CAGGTCTCTGTCACGCTTCT-3′,reverse 5′-AGTATTCATGGAAGGGAATAG-3′;GAPDH引物：forward 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′,reverse 5′-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3′。严格按北京全式金生物技术有限公司提供的试剂盒提取各组细胞总RNA、测定总RNA浓度、合成cDNA、PCR扩增。

构建KLF4过表达质粒 根据KLF4基因引物序列：forward 5′-GAATTCATGAGGCAGCCACCTGGC-3′;reverse 5′-GGATCCTTAAAAATGCCTCTTCATGTG-3′合成KLF4-CDS序列。按QIAGEN质粒小抽说明书提取质粒，测定载体片段的浓度。将目的片段进行扩增及酶切后，测定目的片段的浓度。按载体：目的片段=1∶ 7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比，于22℃连接60 min。取10 μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30 min，之后于42℃水浴中热击90 S，再迅速置于冰上(4℃)放置2～3 min。加入500 μl不含抗生素的SOC培养基于37 ℃,225 r/min振荡培养45 min。离心后弃上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄或卡那等)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养，送测序公司进行测序鉴定。

统计学分析研究结果采用均数±标准差表示，运用GraphPad Prism5作图并进行统计学分析。统计方法为每两组之间的单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

高糖处理不同时间点的MES-13细胞中KLF4蛋白表达KLF4蛋白在MES-13细胞中有表达。高糖处理组与未经过高糖处理组(0h)相比，KLF4蛋白表达水平于高糖处理24h时出现下调(P<0.05)，于高糖处理36h、48h、72h时，出现明显下调(P<0.01)(图1)。因高糖处理48h后，KLF4蛋白表达下降明显，故在后续的实验中，选择48h为高糖刺激时间。

图1 高糖处理不同时间点的MES-13细胞中KLF4蛋白表达

不同浓度5-Az对高糖处理MES-13细胞中KLF4、IL-6、MCP-1蛋白表达的影响高渗组与低糖组相比，KLF4、IL-6蛋白表达无明显差异，MCP-1蛋白表达水平明显上调(P<0.001)。高糖组与低糖组相比，KLF4蛋白表达水平出现明显下调(P<0.001)，IL-6蛋白(P<0.01)、MCP-1蛋白(P<0.001)表达水平明显上调。高糖+5-Az组与高糖组相比，5-Az浓度为0.5 μmol/L、1 μmol/L时，KLF4蛋白表达虽有上调，但无统计学差异，5-Az浓度为2 μmol/L、5 μmol/L时，KLF4蛋白表达水平明显上调(P<0.01)。5-Az浓度为0.5 μmol/L时，IL-6蛋白表达即有下调，但无统计学意义。不同5-Az浓度(1 μmol/L、2 μmol/L，5 μmol/L)时，IL-6蛋白表达均有明显下调(P<0.001)。不同5-Az浓度(0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L)时，MCP-1蛋白表达均有明显下调(P<0.001)(图2)。从以上结果中可见，当5-Az浓度为5 μmol/L时，5-Az对KLF4、IL-6、MCP-1蛋白表达均有明显影响，故我们选择5 μmol/L作为5-Az的干预浓度。

图2 不同浓度5-Az对高糖处理48h的MES-13细胞中KLF4、IL-6、MCP-1蛋白表达的影响

KLF4、IL-6、MCP-1基因在MES-13细胞的表达Lv-KLF4组与Lv-NC组相比，KLF4 mRNA表达明显增加，IL-6、MCP-1 mRNA表达无明显变化。Lv-NC(hi)组与Lv-NC组相比，KLF4 mRNA表达水平明显下调，IL-6、MCP-1 mRNA表达水平明显上调。Lv-KLF4(hi)组与Lv-NC(hi)组相比，KLF4 mRNA表达水平明显上调，IL-6、MCP-1 mRNA表达水平明显下调(图3)。

图3 KLF4、IL-6、MCP-1基因在MES-13细胞的表达

5-Az对高糖处理的MES-13细胞KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表达的影响高渗组与低糖组相比，KLF4 mRNA表达水平无明显变化，IL-6、MCP-1 mRNA表达水平均稍有上调，但无统计学差异。高糖组与低糖组相比，KLF4 mRNA表达水平明显下调(P<0.01)，IL-6 mRNA(P<0.01)、MCP-1 mRNA(P<0.001)表达水平明显上调，而高糖+5-Az(5 μmol/L)组与高糖组相比，KLF4 mRNA表达水平明显上调(P<0.001)，IL-6 mRNA(P<0.05)、MCP-1 mRNA(P<0.01)表达水平明显下调(图4)。

图4 5-Az(5 μmol/L)对高糖处理48h的MES-13细胞中KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表达的影响

讨 论

DKD是DM常见的微血管病变，已成为ESRD的主要原发病之一[11]。DKD的发病是多因素共同作用的结果，其中炎症反应越来越被人关注。在高血糖、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活等病理状态下，肾脏中可出现大量单核/巨噬细胞的浸润，且浸润的炎性细胞和肾脏固有细胞都可产生释放多种炎性因子，如MCP-1、IL-6等，这些炎症因子能通过自分泌、旁分泌的方式，放大炎症反应，最终可引起肾小球硬化和肾小管间质纤维化。

KLF4羧基端有高度保守的DNA结合域，氨基端含高度变异的转录调节域，因此可通过与其他因子相互作用，决定KLF4转录调节活性[12]。KLF4在组织器官中有重要生理功能，参与了许多重要的病理过程，如炎症调控、肾纤维化等[13-14]。KLF4能抑制IL-6、IL-1β、IL-10启动子转录活性，下调IL-6、IL-1β表达，上调IL-10表达[3,10,18]，还可以调节NF-κB炎性反应通路，改善结肠[15]、心肌组织[10]和血管内皮细胞炎症[16]。KLF4还可调控巨噬细胞标记蛋白表达，影响巨噬细胞极化[4,17]、促进骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)聚集，发挥抗炎作用[19]。然而，KLF4也可使动脉发生粥样硬化[21]，可活化如TNF-α、 IL-1α等促炎因子，可与Smad的共激活物p300/CBP相互作用，诱导iNOS生成，发挥促炎作用[20,22]。总之，在调控炎症方面，KLF4在不同组织和细胞中，发挥抗炎或促炎的作用，其调控炎症反应的机制存有差异。

KLF4在哺乳动物体内广泛表达，但在肾小球系膜细胞中是否表达仍不清楚，而DKD作为一种以炎症反应为主要特征之一的疾病，KLF4在DKD中的表达情况仍未见报道。因此，在本研究中，我们采用高糖刺激肾小球系膜细胞(MES-13细胞)建立糖尿病体外模型，明确KLF4在肾小球系膜细胞中的表达。本研究结果发现，KLF4蛋白在MES-13细胞中存在表达。而且在高糖处理MES-13细胞不同时间后，KLF4蛋白于高糖处理24h开始下调，于高糖处理36h、48h、72h时，出现明显下调。由此可见，KLF4蛋白可能参与了DKD的发生发展过程。

Mreich等[6]的研究表明，在高糖刺激的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)及小鼠DKD模型中，KLF4表达明显下调。而在HK-2细胞纤维化模型中，KLF4可降低TGF-β1干预诱导的炎性蛋白MIF、MCP-1表达上调，提示KLF4可抑制HK-2细胞的炎症反应。但KLF4对高糖处理的肾小球系膜细胞炎症的调控尚未见文献报道。为探讨DKD中KLF4对炎症调控的机制，我们在高糖处理MES-13细胞后，观察KLF4和炎症指标IL-6、MCP-1的表达变化。结果显示，高糖(30 mmol/L)处理MES-13细胞48h后，与低糖组及高渗对照组相比，KLF4的mRNA和蛋白表达均明显下调，而IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白表达则显著上调。这提示在糖尿病肾病发病过程中，存在明显炎症反应，这与之前的报道相符合[23-24]，而KLF4可能参与了IL-6、MCP-1表达的调控。为证实这一设想，我们将KLF4基因通过慢病毒转染至MES-13细胞中，在高糖刺激0h、48h时，分别检测KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表达水平，结果提示：在高糖刺激0h的MES-13细胞中，KLF4质粒组与空白质粒组相比，KLF4 mRNA表达水平明显上调，而IL-6、MCP-1 mRNA表达水平无明显变化。高糖刺激细胞48h后，在空白质粒组细胞中，KLF4 mRNA表达水平下调，而IL-6、MCP-1 mRNA表达水平明显上调，而KLF4质粒组与空白质粒组相比，KLF4 mRNA表达水平明显上调，而IL-6、MCP-1 mRNA表达水平出现明显下降。这说明在高糖刺激的MES-13细胞中，KLF4可抑制IL-6、MCP-1的表达而减轻细胞的炎症反应。

表观遗传学可在不改变DNA序列的前提下，调节基因或蛋白的表达。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化在蛋白尿、炎症反应、EMT等多种病理过程中均发挥了重要的作用。甲基化抑制剂5-Az可降低DNA甲基化水平被广泛应用于肿瘤、EMT的研究。宫颈癌组织较正常宫颈组织相比，KLF4 mRNA表达水平显著下调，且其表达与启动子甲基化表现出显著的负相关。应用5-Az后，KLF4的mRNA和蛋白质在宫颈癌细胞中的含量明显增加[8]。同样有研究发现[9]，5-Az可减少DNMT-1的表达，从而恢复KLF4在套细胞淋巴瘤细胞系中的表达。我们的前期研究也发现[10]，在TGF-β1刺激的人HK-2细胞中，5-Az可抑制DNA甲基转移酶1导致的KLF4启动子过甲基化，上调KLF4的表达水平，减轻人HK-2细胞上皮EMT过程。同时Zhang等[7]在DKD模型中发现，DNMT-1、核因子Sp1、NF-κB-p65因子的表达水平显著增加。5-Aza可抑制Sp1/NF-κB p65-DNMT1通路，减轻糖尿病小鼠的蛋白尿。因此，我们推测KLF4在高糖处理的MES-13细胞中表达降低，与KLF4启动子过甲基化有关。故为探讨糖尿病肾病中KLF4对炎症调控的机制，我们应用不同浓度的5-Az，抑制DNA甲基化过程，观察其对KLF4和炎症因子IL-6、MCP-1表达的影响。本研究发现，高糖+5-Az组与高糖组相比，5-Az浓度为2 μmol/L、5 μmol/L时，KLF4蛋白表达水平明显上调。相反，IL-6蛋白表达在5-Az浓度为1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L时，出现显著下调。MCP-1蛋白表达则在5-Az浓度0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L时，均有明显下调。进一步用qPCR方法检测KLF4、IL-6、MCP-1的mRNA表达。结果显示，高糖+5-Az干预组与高糖处理组相比，KLF4 mRNA表达明显上调，IL-6、MCP-1 mRNA表达明显下调。这些结果提示，5-AZ可上调高糖处理的MES-13细胞中的KLF4表达，减少IL-6、MCP-1表达。由此可见，使用5-Az抑制DNA甲基化过程后，在KLF4蛋白上调的同时，肾小球系膜细胞的炎症反应明显减轻，提示糖尿病肾病发病过程中，KLF4表达下调很可能与DNA甲基化有关，而抑制DNA甲基化后，可使KLF4表达上调，炎症反应减轻。但KLF4启动子区域是否发生DNA甲基化，仍需后续研究进一步验证，如KLF4启动子甲基化水平检测。

综上所述，本研究通过高糖刺激肾小球系膜细胞建立体外DKD模型，观察高糖刺激后MES-13细胞中KLF4、IL-6、MCP-1的表达，提示KLF4蛋白可能参与了DKD的发生发展过程。而采用甲基化抑制剂5-Az干预后，可恢复KLF4 mRNA和蛋白表达，减轻IL-6和MCP-1 蛋白及mRNA上调的程度，表明KLF4蛋白表达的恢复可减轻DKD的炎症反应，其机制可能与KLF4启动子区域DNA甲基化相关。本研究为探讨DKD的发病机制及寻找新的治疗靶点提供了理论依据。