填料对HBF工艺处理生活污水的影响及其机制

2018-08-31王文标

净水技术 2018年8期

王文标

(上海泓济环保科技股份有限公司，上海 200433)

HBF工艺(hybrid biological & fixed film technology)是在AO活性污泥法基础上，结合生物膜法的优势而开发出的一种复合式生物膜-活性污泥法工艺[1]，填料是该工艺核心部分。研究表明，不同填料对生物膜法污水处理性能影响显著[2-4]，在生物接触氧化工艺处理生活污水中，软性纤维填料较弹性立体填料和悬浮球型填料，对生活污水中有机物及氨氮的去除效果较好，且填料对生物膜法污水处理性能影响更显著的是对氨氮的去除，而对去除COD的影响较小[4]。然而，在HBF工艺中，填料的不同对其污水处理性能有何影响尚不清楚。

填料的表面性质直接影响其对微生物挂膜性能及附着生物类型[5]。同时，生物膜结构的异质性和微生物分布的复杂性，为生物膜的内部传质和外部传质提供了不同的微环境[6]。为此，污水处理性能的差异可以通过附着生物量、生物相组成及反应器中的传质行为等过程来实现[7]。谭冲等[8]发现不同填料反应器污水去除效率的差异原因可归结为生物膜负载量及生物膜上的微生物菌群组成。Hoang等[9]分析了常温和低温下MBBR系统中生物膜的结构，发现传质的差异可导致生物膜中微生物结构的差异。然而，HBF工艺中不同填料反应器的污水处理性能差异的主要原因并不清楚。

为此，本文开展以下内容的研究：(1)研究不同填料对HBF反应器污水处理效率的影响；(2)不同填料反应器内生物膜干重及脱氢酶活性，揭示其差异形成的初步机制；(3)基于细菌群落结构组成和荧光定量PCR分析，揭示不同填料污水处理性能差异的微生物学机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的填料包括酶浮填料(MT)、聚酯填料(JT)、涤纶填料(DT)、软性填料(RT)、弹性填料(TT)和组合填料(ZT)。采用人工裁剪方式，将前3种填料剪成条状(2 cm×15 cm)，固定在ZT配套的骨架上，且底端固定填料以保证其在反应池中相对稳定的状态。6种填料性质及扫描电子显微镜(SEM)图分别如表1、图1所示。

表1 试验填料及其性质Tab.1 Tested Fibers and Characteristics

注：填料理化性质由上海迅夷检测设备有限公司测定

2.2 试验装置及运行工况

采用有机玻璃反应器(图2)实施废水处理。反应器有效体积为6 L，其污泥浓度(MLSS)为3 000 mg/L，DO为5 mg/L，污泥回流比为100%。反应器采用连续进出水，HRT设置为4～12 h(表2)。人工配置的污水pH值为7.0，CODMn浓度为250 mg/L，TN浓度为50～90 mg/L，TP浓度为3 mg/L及部分微量元素。

2.3 水质指标与分析方法

表2 各阶段工况Tab.2 Working Conditions at Various Stages

2.4 生物膜量及微生物活性测定方法

采用干重法定量评价生物膜负载量[5]。将含有生物膜的溶液用0.45 μm滤膜(使用前称重)过滤，把滤膜置于温控105 ℃的恒温鼓风干燥箱内，干燥至恒重，过滤前后的质量差即为生物膜干重。结果取各反应器运行第20、30、45、60 d及80 d所测结果的平均值。采用TTC-还原法[10]对脱氢酶活性进行测定。结果取各反应器运行第20、30、45、60 d及80 d所测结果的平均值。

图2 反应器示意图(1-原水池；2-泵；3-曝气石；4-填料；5-采样口；6-气泵；7-出水池)Fig.2 Reactor Diagram(1-Influent Tank；2-Pump；3-Air Diffuser；4-Suspended Fibers；5-Sampling Port；6-Compressor；7-Effluent Tank)

2.5 微生物分析

2.5.1 DNA提取及PCR扩增

从每个反应器取适量的生物膜样本，用Power Soil DNA提取盒(Qbiogene Inc.,Carlsbad,CA,USA)按照DNA提取盒内说明书提取DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。PCR 采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。扩增采用的细菌16S rRNA引物序列为338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[11]。AOB引物序列为amoA-1F: 5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′；amoA-2R: 5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′[12]。NOB引物序列为NSR1113R: 5′-CCTGCTTTCAGTTGCTACCG-3′；NSR1264R: 5′-GTTTGCAGCGCTTTGTACCG-3′[13]。

采用50 μL反应体系：10～100 ng模板，25 μL的2×Taq PCR MasterMix，1 μL的25 μmol/L引物，后用超纯水补至50 μL。

PCR反应步骤：95 ℃下预变性10 min；95 ℃下变性15 s，60 ℃退火60 s，共40个循环。全部样本按照正式试验条件进行，每个样本设置3个重复。

2.5.2 Miseq文库构建和Miseq测序

利用NEBNext DNA文库制备试剂盒(New England Biolabs公司，USA)在PCR产物两端加上短接头，构建出DNA文库。经MiSeq reagent kit V2试剂盒(Illumina公司，USA)处理后，委托美吉生物采用MiSeq测序仪进行测序。

2.5.3 功能基因的荧光定量

使用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)中SYBR Green方法对AOB 的amoA及NOB的NSR基因进行定量分析。试验中设置阴性对照，每个样品做3个平行，同时以梯度稀释的质粒DNA和样品DNA进行定量PCR反应。AOB及NOB 定量所用引物参见上述普通PCR扩增。扩增体系均为20 μL：SYBR Green Premix EX Taq酶(Takara，大连)10 μL，浓度为10 pmol/L AOB及NOB 正反向引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，用超纯水补足至20 μL。采用IQ5 Thermocyler扩增仪(RG65HD，Corbett，Australia)进行定量PCR。定量PCR扩增程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；最后在72 ℃延伸10 min。

3 结果与讨论

3.1 填料对HBF反应器的污水处理效率的影响

图3 不同填料反应器的COD(A)及氨氮(B)去除效率Fig.3 Removal Efficiency of COD(A) /Ammonia Nitrogen(B) in Different Filler Reactors

3.2 生物膜量及微生物活性分析

生物膜的形成与生长是实现污水处理的前提，生物膜量及活性是评价生物膜质量的重要依据[18-19]。在废水生物处理中，生物膜脱氢酶活性可反映处理体系中活性微生物量及其对有机物的降解活性，因而成为评价生物膜活性的指标[20]。因此，为揭示不同填料反应器的去除效率差异较大的原因，按试验方法测定了生物膜量及单位质量生物膜的脱氢酶活性，结果如图4所示。

图4 脱氢酶活性和生物膜干重及其与平均去除率回归分析Fig.4 Dehydrogenase Activity and Dry Weight of Biofilm and Regression Analysis with the Average Removal Rate of Ammonia Nitrogen

3.3 生物膜中微生物群落结构分析

按试验方法分析了生物膜的微生物群落。由样本的层级聚类分析[图5(A)]可知，六个样品中的微生物群落可以分为三个不同的类群：第一类包括样本S3、S5及S6；第二类为样本S2；第三类包括样本S1及S4。层级聚类分析结果与对生物膜样本的PCoA主坐标分析[图5(B)]结果一致。主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)，可用来研究微生物群落组成的相似性或差异性。由图5(B)可知，样本S3、S5及S6聚集在一起，S1与S4聚集在一起，且均与S2相距较远。以上结果说明不同填料上微生物组成存在差异。

注：S1-RT；S2-TT；S3-ZT；S4-JT；S5-MT；S6-DT图5 生物膜样本层级聚类分析(A)；细菌群落的PCoA分析(B)Fig.5 Hierarchical Cluster Analysis (A)；PCoA Analysis of Bacterial Community Structure (B) of Biofilm Samples

为进一步揭示其群落结构差异，基于细菌菌门水平(图6)、变形菌门(表3)及菌属水平(图7)分析生物膜上的微生物群落结构组成。由图6可知，从菌门水平来看，不同填料反应器中微生物群落组成的差异不是特别大。6种填料生物膜样本的主要菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)及放线菌门(Actinobacteria)。以MT反应器为例，其生物膜样本变形菌门占比达56.2%，其次是拟杆菌门(25.3%)、厚壁菌门(14.8%)。其他5种填料生物膜样本上的变形菌门占比28%～54.3%，拟杆菌门占比23.5%～57.3%，厚壁菌门占比9.2%～16.1%。该结果与前人研究结果相近，如Ma等[21]在序批式反应器中发现的细菌群落组成中变形菌门(占比最大)、拟杆菌门及放线菌门占优势；Snaidr等[22]在常规活性污泥中对菌群多样性的研究中发现变形菌门(Proteobacteria)为优势类群。在6个样品中还有绿弯菌门(Chloroflexi)、浮酶菌门(Planctomycetes)、绿菌门(Chlorobi)及单胞菌门(Gemmatimonadetes)等，但所占比例均不同。其中绿菌门在颗粒化过程中有重要作用，能够增强污泥的沉降性能。

注：S1-RT；S2-TT；S3-ZT；S4-JT；S5-MT；S6-DT图6 6种填料生物膜上细菌(门)相对丰度条形图(>0.01%)Fig.6 Relative Abundance Barplot of Bacteria (Phylum) in Biofilm on Six Kinds of Biofilm(>0.01%)

表3 各生物膜样本中变形菌门微生物的分布比例Tab.3 Distribution of Proteobacteria in Various Biofilm Samples

注：S1-RT; S2-TT; S3-ZT; S4-JT; S5-MT; S6-DT图7 6种填料生物膜上细菌(属)相对丰度热图(总丰度前30的物种)Fig.7 Relative Abundance Heat Map of Bacteria (Genus) in Six Types of Fillers (Total Abundances of First 30 Species)

如表3、图7所示，从变形菌门微生物的分布、细菌菌属水平分析可看出填料的差异对微生物群落组成形成了显著差异。由图6可知，各填料生物膜样本中变形菌门的占比较大。变形菌门又分为五类，分别为α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲和ε-变形菌纲。国内外研究[23]发现，大多数在生物脱氮、生物除磷及诸多污染物降解过程中起重要作用的微生物均归属于变形菌门，其中β-变形菌纲包括某些AOB[包括亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira等)]在内等很多好氧或兼性菌，且AOB是其主要成员[24-25]；γ-变形菌纲则包括肠杆菌科(Enterobacteraceae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)等；δ-变形菌纲包括脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫菌属(Desulfobacter)及NOB类的硝化刺菌属(Nitrospina)等菌属。

由表3可知，各样品中β-变形菌纲及γ-变形菌纲类较多，这与Lin等[26]在人工污水系统中发现最丰富的菌种为β-变形菌纲，其次是γ-变形菌纲结果相似。以MT生物膜样本为例，β-变形菌纲、γ-变形菌纲及δ-变形菌纲占比分别达33%、16%及6%。

由图7可知，在6个生物膜样本中检测出的假黄单胞菌属(Pseudoxanthormonas)及不动杆菌属(Acinetobacter)等菌属已被证明具有硝化作用，其中假黄单胞菌属能高效去除氨氮[27-28]。其中，MT生物膜样本中假黄单胞菌属占比达0.62%，不动杆菌属占比达4%。在6个生物膜样本中还检测出了具有反硝化作用的热单胞菌属(Thermomonas)，主要原因可能是随着微生物的生长，生物膜变厚，生物膜内部存在局部厌氧。

综合以上对生物膜上微生物的群落结构分析结果可知，不同填料反应器中的微生物组成还是存在较大差异的。其中MT反应器生物膜样本变形菌门占比最多。结合图3(B)各反应器对氨氮的去除率，MT生物膜相比于其他5种填料生物膜可能存在相对较多的硝化菌，且包括大部分脱氮菌的变形菌门也占比最多(56.2%)。这可能就导致MT反应器的污水去除效果较好。为进一步确定各反应器生物膜样本中硝化菌数量差异，本试验对生物膜样本上的硝化菌进行了功能基因(amoA、NSR)荧光定量PCR分析。