姜黄素对衰老小鼠卵巢功能的影响

严正杰 戴有金 侯道荣

(南京医科大学第一附属医院生殖医学科,江苏 南京 210029)

我国已步入老龄化社会，预计10年内中国将有超过2.7亿妇女进入绝经期，即女性卵巢功能的全面衰退〔1〕。由此将引发严重的围绝经期症状和诸多老年性疾病，如心血管疾病、骨质疏松、老年性痴呆、肿瘤、肥胖等〔2〕。围绝经期综合征多采用激素替代疗法(HRT)有禁忌证和潜在致癌危险。中医药因其具有全身调理作用及较小的毒副作用而在该领域有着广泛的应用前景〔3〕。姜黄素是从植物姜黄根茎中提取出来的一种可食用的酚类色素。研究表明〔4～6〕，姜黄素具有很强的抗氧化、抗衰老和抗炎症活性，但其对女性生殖内分泌、卵巢功能和氧化应激方面的影响未见报道，本研究探讨姜黄素对D-半乳糖(gal)致衰老雌性小鼠卵巢功能的影响。

1 材料与方法

1.1动物 雌性C57BL/6小鼠60只，体质量(22±2)g，购自南京医科大学医药实验动物中心。实验动物生产许可证号：SCXK (苏)2016-0002。饲养室温度20～25℃。相对湿度40%～70%。实验动物中心使用许可证号：〔SYXK (苏)2013-0015〕。动物自由饮食并置于在室温18～22℃，相对湿度65%，光照周期12 h∶12 h条件下饲养。

1.2药品和仪器 姜黄素(Curcumin，2A-81025.1-5)，美国Cayman公司；D-gal(D-(+)Galactose，G0750)，美国Sigma 公司；P16抗体(ab81278)，美国Abcam公司；Trizol(B5704-1)和RT-PCR试剂盒(RR037A)，日本Takara 公司；引物，南京锐真生物公司；Q-PCR试剂盒，LC96，瑞士Roche 公司；Q-PCR仪，美国Applied Biosystems公司；全自动组织脱水机、包埋机，日本樱花公司；雌激素(E2)和孕激素(P)检测试剂盒，美国Cayman公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.3动物分组和模型建立 60只C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、D-gal组和姜黄素组，每组20只。D-gal组颈部皮下注射D-gal(100 mg·kg-1·d-1)〔7〕；姜黄素组在D-gal注射造模的同时腹腔注射姜黄素(100 mg·kg-1·d-1)〔5，8〕；空白对照组颈部皮下注射相同体积生理盐水；1次/d，6 w后取各组血清和卵巢做相关检测。

1.4始基卵泡计数 卵巢固定包埋后，沿纵轴行连续切片，厚度为4 μm，每5片贴于一张载玻片上。取标号为奇数的切片进行采用苏木精-伊红(HE)染色后由两人参考Tilly〔9〕方法，对始基卵泡进行计数。各级卵泡形态特点为：始基卵泡，每个卵母细胞周围有一层扁平的颗粒细胞；初级卵泡，每个卵母细胞周围一层或多层立方形颗粒细胞；次级卵泡，每个卵母细胞周围增至6～12 层立方形颗粒细胞；窦状卵泡，多层颗粒细胞，卵泡出现明显的窦腔。

1.5血清E2和P检测 采用阴道涂片法观察小鼠动情期，在小鼠动情前期眼眶取血，离心，分离血清，按ELISA试剂盒说明书检测血清中E2和P水平。

1.6卵巢组织SOD和MDA检测 每组小鼠处死后，迅速打开腹腔取出卵巢组织，准确称取重量。在冰盘上用冷生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，放在小烧杯中按重量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例加入冷生理盐水，然后在冰上用眼科小剪刀尽快剪碎组织，放入匀浆管，补足冷生理盐水制成组织匀浆。组织匀浆4℃离心10 min(3 000 r/min)，取上清液进行SOD活性、MDA含量测定。具体操作方法按试剂盒说明书进行。

1.7卵巢组织抗苗勒管激素(AMH)、SOD2和过氧化氢酶(CAT)mRNA的表达 在1.5 ml无RNA酶离心管中将卵巢组织剪碎后，使用超声研磨机制成组织匀浆。使用Trizol裂解细胞并抽提组织RNA。参照RT-PCR试剂盒说明书逆转录成cDNA用于目的基因PCR扩增。利用Applied Biosystems realtime PCR连续荧光检测系统扩增，程序设定为预变性95℃，2 min；变性95℃，10 s；退火温度，20 s；延伸72℃ 20 s；共40个循环。于72℃处收集荧光。以每个样本在同一批反应的GAPDH为内参照。各基因引物序列见表1。采用GraphPad Prism5软件进行数据分析处理。

表1 RT-PCR引物列表

1.8Western印迹检测 取出-80℃条件下保存的卵巢组织，严格按照试剂盒说明书操作提取蛋白，将得到的蛋白在-80℃条件下保存待用。上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%胎牛血清封闭，先后加入P16一抗和辣根过氧化酶标记的二抗。增强化学发光法显色，每组重复3次。采用Bio-RAD公司的凝胶成像系统进行拍照。

1.9统计学方法 应用SPSS11.0 统计软件行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1血清E2、P和卵巢组织MDA、SOD水平 D-gal组较空白对照组血清E2、P及卵巢组织SOD水平明显下降(P<0.01)，卵巢组织MDA则明显上升(P<0.01)；与D-gal组比较，姜黄素组血清E2和P及卵巢组织SOD水平显著上升(P<0.05)，卵巢组织MDA则显著下降(P<0.01)。见表2。

表2 各组血清P和E2水平和卵巢组织匀浆MDA和SOD水平比较

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与D-gal组比较：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

2.2卵巢始基卵泡计数 与空白对照组(27.78±2.58)比较，D-gal组卵巢始基卵泡计数(16.34±1.45)显著减小(P<0.01)，而姜黄素组(20.65±1.82)较D-gal组显著上升(P<0.05)。

2.3卵巢组织AMH、CAT和SOD2 mRNA的表达 与空白对照组相比，D-gal组AMH mRNA表达显著下降而CAT mRNA和SOD2 mRNA表达显著升高(P<0.01)；与D-gal组比较，姜黄素组AMH mRNA表达显著升高(P<0.05)，而CAT mRNA和SOD2 mRNA表达显著下降(P<0.05和P<0.01)。见表3。

2.4卵巢组织P16蛋白检测 蛋白P16在空白对照组表达较低，在D-gal组表达最高，而姜黄素组相对于D-gal组明显降低。见图1。

表3 各组卵巢AMH、CAT、SOD2 mRNA表达

图1 各组P16蛋白在卵巢组织中表达

3 讨 论

卵巢的发育和衰老是一个多因素调控的复杂过程〔8〕，并且卵巢的衰老速度比身体其他器官要更快。卵巢衰老主要表现在卵泡数量和质量逐渐下降，这是一个多因素相互作用、逐渐累积的复杂生物过程〔10〕。目前对机体衰老最有力的解释来自于“自由基”衰老理论。这一理论由Harman〔11〕首先提出。自由基是指细胞内正常代谢产生的活性氧簇等，其可对细胞内生物大分子等攻击进而引起的细胞功能缺陷。有研究表明〔12，13〕，细胞内氧化应激压力升高是造成细胞衰老的主要原因。D-gal可在D-gal氧化酶的作用下生成乙醛糖和过氧化氢，使活性氧增多，脂质过氧化亢进，产生过量的超氧阴离子自由基，进而导致机体衰老〔14〕，且能引发卵巢早衰〔15〕。女性生殖衰老的实质是卵巢衰老，其核心观点是卵巢中始基卵泡数量逐渐减少、卵母细胞质量逐渐下降〔16〕。卵泡数量减少是卵巢衰老的主要特征之一，因此卵泡生长情况是检测卵巢衰老的一个重要指标〔17〕，始基卵泡下降是卵巢衰老最显著特点〔18〕。本研究D-gal表明姜黄素能抑制D-gal对卵母细胞和原始卵泡的破坏作用，加快卵母细胞巢破裂，促进始基卵泡形成并抑制卵母细胞凋亡，维持其储备量；与陈振国等〔8〕研究结果一致。

妇女进入中年以后，卵巢功能逐步衰退，雌激素分泌减少。E2和P是反映性激素水平的经典指标。在绝经期女性中，内分泌紊乱，卵巢功能衰退，E2和P明显降低〔19〕。本研究D-gal导致小鼠出现了卵巢老化的状态，姜黄素能够抑制卵巢活性氧自由基反应，调节机体生殖内分泌功能，延缓卵巢的衰退。AMH是由生长卵泡即初级卵泡和小窦状卵泡的颗粒细胞分泌，可调节卵泡的生长。研究发现〔20〕，AMH在血清中含量随增龄逐渐下降，在绝经前5～15年，AMH水平呈对数级下降，直至低到不可测定；同时由于AMH在月经周期的不同时期表达水平相对不变。因此目前认为AMH能够作为卵巢始基卵泡池大小的标志〔21〕。根据自由基理论，由活性氧等引起的细胞内氧化损伤是造成衰老的重要因素〔22〕。抗氧化酶系如：SOD2和CAT是体内最重要的两种抗氧化酶，其表达量随着氧化应激压力升高而升高。SOD2 将超氧化物转化为过氧化物，而紧接着由CAT将过氧化物转化为水〔23〕。本研究发现姜黄素能够改善卵巢功能并且缓解卵巢的氧化应激压力。研究表明〔24〕，P16与细胞衰老有着紧密联系，P16的过量表达会诱导细胞发生提前衰老，这也是P16抑制肿瘤发生的机制，目前认为P16可以作为组织和细胞衰老的标志。P16诱导衰老的分子机制是P16作为细胞周期依赖性激酶抑制因子，使细胞周期停滞而发生衰老。P16基因表达增高，能够抑制cyclinDl、CDK4的活性，使靶蛋白不能磷酸化。未磷酸化或低磷酸化的Rb蛋白能够与多种蛋白结合，其中E2F被Rb蛋白结合时，不能发挥转录因子的作用，其活性处于被抑制状态，导致细胞由G1期进入S期停滞〔25〕。在多种细胞系中亦观察到P16表达和衰老及细胞氧化应激压力相关〔26，27〕。P16蛋白在青年动物组织内表达较少，随着年龄增长其表达量亦随之上升。本研究表明姜黄素抑制了D-gal引起的小鼠卵巢P16蛋白增高，对D-gal所致小鼠卵巢的衰老具有明显抑制作用。

本研究结果表明，姜黄素具有较强的抗卵巢衰老作用，但其对小鼠繁殖性能的影响及抗卵巢衰老的具体作用机制还有待进一步研究。