百香果果汁对衰老小鼠学习记忆、抗氧化的影响及其机制

韦家河 冯 霞 吴开慧 冯 洁 农生斌 韦玲林 韦 妮 焦 雯 黄彦峰

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

我国老龄人口众多，抗衰老的研究尤为重视。百香果是西番莲科多年生木质藤本植物果实的通称，食用和药用价值兼备，主要用于制备果汁，大量食用也不易引起毒性反应，有较高的安全边际〔1〕。有研究表明，百香果中富含有机酸、不饱和脂肪酸和人体必需脂肪酸等，具有镇静、抗癫痫、降血糖、降血脂和抗氧化等功效〔2～5〕。本实验拟分析百香果果汁对衰老小鼠学习记忆、抗氧化能力的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1一般资料 昆明种健康小鼠，雌雄各半，体重(25±3)g，右江民族医学院实验动物中心提供(动物生产许可证号：SCXK桂2012-0003)。百香果(广西百色市售)；D-半乳糖(美国Amresco公司)；维生素C(遂成药业股份有限公司国药准字 H4103317)。考马斯亮蓝蛋白、一氧化氮(NO)、NO合酶(NOS)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供。离心机(上海安亭科学仪器厂)；FSH-2A可调高速电动匀浆机(金坛市金南仪器厂)；电子天平〔梅特勒-托利仪器(上海)有限公司〕；电热恒温水温箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)； 722 型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；BA-6小鼠测试避暗仪、DT-6小鼠跳台测试仪(均为成都泰盟科技有限公司生产)。

1.2百香果汁的制备 取鲜果去皮后榨汁，再用4层纱布过滤，滤出的原汁为高浓度剂量组，用蒸馏水将原汁稀释一倍为中浓度剂量组，再将中浓度的果汁稀释一倍为低浓度剂量组，冰箱冷藏，用时恢复至室温。

1.3动物分组及喂养 小鼠48只，雌雄各半，同室分笼喂养。适应喂养5 d按体重随机分为正常组、模型组、阳性组、百香果高、中、低剂量组。每天下午加满料块及饮水，并于次日早上检查，补充料块及饮水。温度18～22℃，相对湿度50%～70%。

1.4模型复制及给药 临用前将D-半乳糖配制成10%生理盐水溶液，正常组每日腹腔注射等体积0.9%NaCl溶液，其余各组每日均按100 mg/kg腹腔注射D-半乳糖，1次/d，连续42 d。腹腔注射的同时，百香果治疗组分别按高、中、低剂量，阳性组按100 mg/kg灌胃维生素C，正常组和模型组灌胃等量生理盐水。

1.5学习记忆能力的测试

1.5.1跳台实验 给药第40天进行跳台实验，打开小鼠跳台测试箱,把小鼠放入跳台仪中,再通 36 V 交流电,动物受到电击,其逃避反应即为跳上平台。多数动物会再次或多次跳至铜栅上,受电击后又迅速跳回平台,训练5 min,记录每只小鼠受电击的次数作为学习成绩(EN1)。第41天,在通电下,直接将小鼠置于平台上,记录从小鼠放上平台到第1次跳下的时间为潜伏期(LT);小鼠受电击后会逃避性的跳上平台,然后记录5 min内小鼠再次跳下的次数(EN2)为错误次数，LT和EN2共同作为记忆成绩。

1.5.2避暗反应实验 避暗仪暗室底部铜栅通36 V、50 Hz交流电，先把小鼠放入避暗仪反应箱中训练3 min，小鼠受电击逃往明室。测试开始时，将小鼠头部背对洞口放入明室，进入暗室则受到电击，避暗仪自动记录5 min 内小鼠进入暗室的次数，即为错误次数，首次进入暗室的时间为避暗LT。采用多次测试法：第40天上午9∶00 开始训练实验，当日下午15∶00，次日上午9∶00 和第42天上午9∶00(训练实验48 h后)分别测试3次，取平均值记录5 min内小鼠避暗LT和错误次数，以此反映小鼠的记忆能力。

1.6各脏器指数测定 各组灌胃给药结束且完成行为学测试后，颈椎脱臼处死小鼠，在冰面上取脑、胸腺、心、肝、肾和脾，冰生理盐水冲洗干净后滤纸吸干，分析天平准确称量其湿重，各脏器指数=脏器湿重(mg)/体重(g)。

1.7生化指标测定 称重后的脑组织用冰冻生理盐水按1∶9制备10%的组织匀浆，以3 500 r/min离心15 min后取上清液，严格按照试剂盒说明书进行。

1.8统计学方法 使用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1百香果果汁对小鼠一般情况的影响 造模30 d后,百香果中浓度组毛色光滑,行动活跃，反应灵敏与正常组相近，其余实验组毛色发黄,无光泽,皮肤松弛,行动缓慢,精神萎靡，容易抓取。

2.2各组体重比较 实验开始后各组体重都有所增长，但各组差异无统计学意义(P>0.05)，第28天，模型组和百香果各浓度组较前1 w下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；第42天，模型组明显低于正常组(P<0.01)，阳性组与百香果中浓度组明显高于模型组(P<0.01,P<0.05)，见表1。

2.3各组脏器指数比较 与正常组比较，模型组脑、心、肝、胸腺、肾及脾指数明显下降(P<0.01)；与模型组比较，各组脑、胸腺、肾脏指数均保持较高水平，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，阳性组、百香果高、低浓度组心、肝指数也保持较高水平，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表1 各组体重比较

与模型组比较:1)P<0.01；2)P<0.05

表2 各组脏器指数比较

与正常组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.05,3)P<0.01

2.4各组学习记忆比较 与正常组比较，跳台实验和避暗实验模型组LT明显缩短，错误次数明显增加(P<0.01)；与模型组比较，跳台实验中百香果低浓度组LT差异无统计学意义(P>0.05)，其余各组LT明显增加，错误次数明显减少(P<0.01)，避暗实验中，各组LT均明显增加，错误次数明显减少(均P<0.01)。见表3。

表3 各组学习记忆比较

与正常组比较:1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

2.5各组脑组织生化指标比较 与正常组比较，模型组CAT活力、GSH含量、SOD活性均显著下降(P<0.01)，NO含量、NOS活力、MDA含量和AchE活性显著上升(P<0.05，P<0.01)；与模型比较，阳性组、百香果中、低浓度组CAT活力、GSH含量和SOD活性均明显升高(P<0.05，P<0.01)，NO含量、MDA含量和AchE活性明显下降(P<0.05，P<0.01)，百香果高浓度组SOD 活性也显著升高(P<0.01)，NOS活力、MDA含量和AchE活性明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 百香果果汁对小鼠脑组织生化指标的影响

与正常组比较:1)P<0.05；2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05；4)P<0.01

3 讨 论

衰老是一种正常的生理现象，伴随着一系列全身性、多方面的退行性变化。小鼠腹腔注射D-半乳糖造模方式简便,周期较短，结果稳定，节省时间及资金,是目前国内应用较多的衰老模型，被广泛应用于脑老化、抗衰老研究〔6，7〕。本实验结果与相关研究结果相近〔8，9〕。跳台实验是用来评价实验动物学习记忆能力的经典研究方法。本实验结果说明百香果果汁对小鼠学习记忆有改善作用。

D-半乳糖致衰老模型主要通过氧化应激积累积体内MDA含量,降低SOD和GSH-Px的活性引起〔10〕。张常娥等〔11〕研究表明D-半乳糖致衰老的主要机制是氧自由基引起的过氧化损伤，其在体内代谢过程中产生超氧阴离子自由基和过氧化氢(H2O2)，对机体造成损伤。CAT、SOD和GSH都是体内重要的抗氧化剂，可以有效降低机体活性氧类和过氧化物的生成，间接反映机体清除自由基、保护机体免受自由基损伤的能力，CAT和GSH可清除H2O2,MDA是脂质过氧化的代谢产物，反映机体脂质过氧化水平，代表组织氧化损伤程度〔12〕。本实验结果说明百香果果汁够提高机体内各种抗氧化系统相关酶活性，减轻机体过氧化损伤程度从而延缓衰老。

NO是神经传导的逆信使，在学习记忆中发挥重要作用，NOS是NO产生的关键酶,两者的水平呈正相关，NO产生过多则引起脑功能衰退,AchE是乙酰胆碱(Ach)的分解酶，其活力可间接反映Ach的含量和胆碱能神经功能的情况，老年人体内单胺类神经递质和胆碱能神经递质的减少直接导致老年痴呆的形成〔13，14〕。本实验结果显示，百香果果汁能够显著降低脑AchE活性、NO和NOS水平，从而保护胆碱神经功能，减轻NO对神经细胞的毒性，起到改善小鼠学习、记忆能力的作用，其机制可能是抑制AchE活性，提高乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱M受体表达量，进而维持脑内乙酰胆碱水平稳定。

综上，百香果果汁可以改善衰老小鼠学习记忆能力，提高脑组织的抗氧化能力，有较好延缓衰老的作用，其机制可能与清除机体过多自由基、提高机体抗氧化能力、减轻NO对神经细胞的毒性等有关。