补阳还五汤对脑损伤大鼠脑组织凋亡信号通路的影响

仇志富 吴晓光

(承德医学院中药研究所，河北 承德 067000)

胞内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号转导通路是脑出血损伤所出现的细胞凋亡活动中很有影响力的信号通路，可以通过对凋亡蛋白或基因进行抑制而发挥效果〔1〕。补阳还五汤是临床上用于治疗缺血性、出血性脑病的常用药物之一，其能通过减少神经元死亡、促进神经修复再生等机制来发挥防治作用〔2〕。脑出血研究中补阳还五汤能够激活数条与细胞凋亡联系密切的信号转导通路，然而其对PI3K/AKT信号通路的研究一直无人问津。本实验以经典方法复制脑出血大鼠模型，给药干预一定时间后检测脑组织PI3K/AKT信号通路的两大组成蛋白——PI3K、AKT蛋白表达变化，检测凋亡密切相关蛋白——Bcl-2、BAX的表达变化和脑水肿、脑组织细胞凋亡变化，研究补阳还五汤对脑出血的作用效果及深层作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及主要的试剂 实验动物为成年雄性清洁级SD大鼠，数量为72只，体质量(250±20)g。补阳还五汤的药物组成及用量：生黄芪(120 g)、赤芍(4.5 g)、当归尾(6 g)、川芎(4.5 g)、桃仁(3 g)、干地龙(3 g)、红花(3 g)，购自承德大药房，银杏叶片成品由双鹤药业有限公司所提供。AKT、PI3K免疫组化试剂盒，购自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2、BAX多抗，购自上海延生实业有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒，购自北京天恩泽基因科技有限公司，其他试剂皆为国产分析纯。

1.2动物分组和处理 实验用SD大鼠随机分成4组：假手术组(18只)、模型组(18只)、补阳还五汤组(18只)、银杏叶片组(18只)。补阳还五汤组、银杏叶片组灌胃给药，药量分别为26 g·kg-1·d-1和3.5 mg·kg-1·d-1(均按人和大鼠间体表面积折算的2倍剂量给药)，假手术组及模型组给予生理盐水。

1.3分别作如下处理 补阳还五汤组、银杏叶片组、模型组大鼠模型的制备采用文献方法〔3〕：以10%水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠后，于立体仪上固定，于头部正中行纵行切口，将大鼠骨膜剥离，使其冠状缝和前囟裸露。在前囟之前约2.0 mm、中线右侧约3.0 mm处钻一约1.0 mm直径的小孔。以微量注射器从股动脉抽取适量的血液，借助立体定向仪沿钻孔垂直进针6.0 mm左右，缓缓注血80 μl，留针10 min后撤针，以消毒针缝合切口。假手术组仅仅裸露颈总动脉、神经。在造模后第28天起，补阳还五汤组、银杏叶片组均以灌胃给药方式连续给药5 w；其余组别给予适宜的生理盐水。

1.4PI3K、AKT蛋白表达检测 Leica石蜡切片机连续冠状切片，片厚5 μm，4℃冰箱保存，用于凋亡蛋白与基因的免疫组化测试，其中PI3K一抗的稀释度为1∶150、AKT一抗的稀释度为1∶100。严格按照试剂盒要求进行操作，高背景下观察阳性细胞表达变化。

1.5凋亡调控蛋白的检测 免疫组化SABC法进行凋亡调控蛋白的检测，高倍镜下进行观察，凋亡调控蛋白的阳性表达呈现棕黄色。

1.6脑组织含水量检测 脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.7细胞凋亡数量检测 TUNEL法检测细胞凋亡变化，严格按照TUNEL凋亡检测试剂盒操作说明进行。

1.8血脑屏障(BBB)通透性检测 伊文恩蓝(EB)法检测大鼠脑组织血脑屏障通透性。

1.9统计学处理 以SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析法、LSD及Games-Howell法检验。

2 结 果

2.1PI3K/AKT信号通路的影响 信号通路的两大蛋白皆位于胞质之上，其阳性细胞的表达呈现棕黄色。同假手术组进行比较，模型组PI3K、AKT显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组与银杏叶片组PI3K、AKT显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1，图2。

2.2脑组织含水量的变化 模型组大鼠脑组织含水

量显著高于假手术组(P<0.05)；补阳还五汤组、银杏叶片组大鼠脑组织含水量显著低于模型组(P<0.05)。 见表2。

2.3脑组织中EB含量的变化 通过EB含量变化来反映BBB通透性变化，EB含量升高，BBB通透性增强；反之，BBB通透性降低。模型组大鼠EB含量明显高于假手术组(P<0.05)。补阳还五汤组、银杏叶片组大鼠脑组织EB含量明显低于模型组(P<0.05)。 见表2。

2.4Bcl-2、BAX蛋白表达变化 神经元胞质呈棕黄色结果即为Bcl-2、BAX蛋白的阳性表达。在假手术组中Bcl-2和BAX通常也会有少量的表达，但是其Bcl-2/BAX的比值却始终接近于1，与模型组比较，补阳还五汤组和银杏叶片组Bcl-2/BAX比值显著升高(P<0.05)，Bcl-2/BAX比值远大于1。见表3。

2.5细胞凋亡数量的变化 假手术组大鼠大脑皮质内可见零星的、散在的TUNEL阳性细胞〔(0.92±0.06)个/视野〕，模型组大鼠血肿周围皮质TUNEL阳性细胞较假手术组显著增加〔(6.34±2.01)个/视野，P<0.05〕；补阳还五汤组〔(3.97±1.45)个/视野〕和银杏叶片组〔(4.65±1.98)个/视野〕TUNEL阳性细胞较模型组显著减少(P<0.05)。

表1 各组信号通路蛋白表达比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

图1 各组PI3K蛋白表达变化(DAB，×200)

图2 各组AKT蛋白表达变化(DAB，×200)

组别EB(μg/g)脑含水量(%)假手术组4.03±0.7059.97±2.59模型组26.53±1.091)78.76±5.201)银杏叶片组17.58±0.982)73.56±4.192)补阳还五汤组14.66±0.872)69.87±3.652)

表3 各组脑组织Bcl-2、BAX蛋白的比较

图3 各组凋亡细胞表达变化TUNEL法(×400)

3 讨 论

与脑出血后细胞凋亡密切相关的通路——PI3K/AKT信号通路，其激活过程大体来讲分为四步：①某些物质或刺激激活酪氨酸激酶活性受体；②PI3K激活；③丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活；④磷酸化以后的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶对下游凋亡靶蛋白进行调控，来发挥脑保护效果〔4～6〕。总之，PI3K/AKT信号通路激活后，能够作用于Bcl-2、BAX、Caspase-3、核因子(NF)-κB等下游凋亡靶蛋白，通过激活或抑制它们的表达来发挥生物学效应。本实验在建立脑出血模型大鼠的基础上，以补阳还五汤灌胃给药，发现给药组PI3K、AKT蛋白阳性表达显著升高，细胞凋亡数量显著降低，此结果与李峰等〔7〕在补阳还五汤对脑缺血大鼠的影响研究中所得结果一致，提示脑出血中补阳还五汤能发挥抑制神经细胞凋亡的脑保护效果必然与PI3K/AKT信号通路的激活密不可分。

BBB通透性的改变作为脑水肿发生的决定性因素，最终导致了脑水肿现象的出现，两者作为出血性脑损伤病理性变化的重要方面，对于疾病的发展与预后起到了很大的影响。BBB通透性破坏引发的脑水肿对于迟发性神经细胞损伤和凋亡发挥着促进作用，使细胞功能障碍和坏死现象加重，因此两者经常被选为衡量出血性脑病治疗效果的指标〔8〕。本研究发现，补阳还五汤给药后，大鼠脑组织BBB通透性降低，脑水肿现象减轻，补阳还五汤发挥了较好的脑保护效果。Bcl-2、BAX作为Bcl-2家族的两类标志性凋亡蛋白，Bcl-2/BAX比值直接影响细胞凋亡状态—促进或抑制，Bcl-2/BAX比值越大，则对凋亡起抑制作用越明显，反之，则促进凋亡。二者发挥作用的方式都是经过上游生物学信号激活之后，通过对相关下游基因的激活来完成的，其中PI3K/AKT信号通路便可激活二者，调节两者之间的比值变化〔9～14〕。本研究中补阳还五汤给药后，两者比值发生显著性变化，提示由PI3K/AKT信号通路的激活引发了Bcl-2/BAX值变化。

综上，补阳还五汤能够降低BBB通透性，同时亦可激活PI3K/AKT信号转导通路，通过调控Bcl-2、BAX的阳性表达发生相应变化，即调节二者之间的比值来实现减轻脑水肿、抑制细胞凋亡的生物学效应。随着对细胞凋亡和与其机制密切相关的信号转导通路的深入研究，我们能够对脑出血产生更进一步的了解和熟悉，在脑出血的临床治疗中提出更加先进的切入点和治疗思路。PI3K/AKT信号通路作为相当重要的凋亡通路，其在被激活以后能够调控多种凋亡相关蛋白和基因，然而由于本实验内容有限，仅仅针对Bcl-2和BAX两大类凋亡蛋白进行了探究，尚有多种凋亡相关蛋白和基因有待进一步的研究；与此同时，信号转导通路众多，其是否能够激活其他重要的通路仍然不得而知，故其具体的机制亟待进行更深入探索。