丁苯酞对慢性酒精中毒大鼠海马硫化氢及CA1、CA3区五羟色胺的影响

杜爱林 王昊阳 代 玄 侯佳宝 张向阳 罗晓秋 张瑞岭

(新乡医学院生理学与神经生物学教研室 中英脑功能损伤联合实验室 河南省高校脑研究重点实验室培育基地，河南 新乡 453003)

慢性酒精中毒是长期过量饮酒引起的中枢神经系统功能障碍，表现为患病个体对酒的强烈渴求，并且在停止饮酒后出现如出汗、震颤、呕吐与坐立难安等症状。现有研究表明，慢性酒精中毒会增加罹患心脑血管疾病的风险，造成脑部神经元的损伤且导致个体学习记忆能力的减退〔1〕。丁苯酞(NBP)作为我国自主开发的一类创新性药物，为人工合成的消旋体，其左旋体存在于芹菜种子中。研究发现〔2〕，其能够抑制Ca2+内流，保护线粒体，影响脑能量代谢和缺血脑区的微循环和血流量，改善受损中枢神经系统的功能。 本实验观察高、中、低剂量的NBP对慢性酒精中毒大鼠的影响，并测定海马硫化氢(H2S)含量及CA1、CA3区5-羟色胺(5-HT)的阳性结果表达情况，探讨NBP对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力及脑部海马区的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 90只清洁级健康雄性SD大鼠，体重120～160 g，由新乡医学院动物管理中心提供，实验前在22～25℃实验室中饲养5～7 d以适应实验室环境。随机分为正常对照组(NC组)，NBP低剂量组(NL组)、NBP中剂量组(NM组)、NBP高剂量组(NH组)、慢性酒精中毒模型组(M组)，每组18只。

1.2仪器与试剂 超低温冰箱由美国Thermo Forma公司提供；高速冷冻离心机由德国Heraeus公司生产；Eclipse E200显微镜由日本Nikon公司提供；Bio-Tek ELx800酶标仪由美国Bio-Tek公司生产； NaHS由美国ACROS公司提供；5-HT系北京博奥森有限公司生产；H2S测定试剂由郑州九是公司提供；SP检测试剂盒与二氨基联苯胺(DAB)试剂盒由中杉金桥公司生产。

1.3模型建立 除NC组外，各组饮含6%(V/V)酒精水溶液42 d，酒精溶液每日9∶00配制，置换。28 d后，NBP用植物油稀释后每日灌胃1次，剂量设定为NL组NBP 10 mg/kg，NM组NBP 20 mg/kg，NH组NBP 40 mg/kg，NC组等剂量植物油灌胃5 ml/kg(大约14 d)。

1.4学习和记忆能力评价 各组进行Y型电迷宫测试〔3〕，Y型电迷宫分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个臂，随机选择作为安全区。每臂顶端设立一个信号灯，灯亮后提示此臂为安全区。所有学习记忆测试均在晚间暗光、安静下进行，将大鼠置于迷宫中，并打开3条臂的指示灯，让其适应环境，适应3 min后将灯熄灭。随机打开其中一臂的指示灯，指示灯不亮的两臂自动延迟5 s后通电电击大鼠，直至大鼠逃避到安全区为止，然后灯亮持续15 s后熄灭，完成1次测试。大鼠在10 s内一次直接逃至安全区为正确反应，否则为错误反应。以10次电刺激后有9次做出正确反应为学会，用大鼠作出正确反应所需训练的次数来表示其空间分辨反应的学习记忆成绩，训练次数越少，说明大鼠学习能力越强。

1.5分光光度法间接测定海马组织中H2S的含量 采用亚甲蓝分光光度法〔4〕。各组均随机抽取8只大鼠取脑组织，用研磨管在-20℃温度下进行研磨，倒入5 ml玻璃试管中，用冰预冷的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)匀浆(1.2 g/L)，12 000 r/min，4℃，离心10 min，之后，取0.1 ml上清液移至另一离心管中，在室温下加入1%醋酸锌0.5 ml，振荡混匀，孵育10 min。然后依次加入20 mmol/L N，N-二甲基苯二胺0.5 ml及30 mmol/L三氯化铁0.5 ml，室温孵育20 min使之充分显色。再加入10%三氯乙酸1 ml和三蒸水2.5 ml使反应终止。再次离心(6 000 r/min，4℃，10 min)，收集清澈的上清液。使用美国Bio-Tek ELx800全自动酶标仪在波长670 nm处测定上清液吸光度，根据H2S标准曲线计算溶液中的H2S含量，海马组织中硫化氢含量以单位重量的组织H2S量(nmol/g)表示。

1.6免疫组化测定5-HT含量 每组随机选取8只大鼠用作免疫组化检测，取脑、固定、包埋、切片。石蜡切片经脱蜡复水后，进行免疫组化，DAB显色，常规脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察并摄片。在高倍显微镜(400×)下每张切片随机摄取双侧海马CA1、CA3区各4个视野图片，用image-pro-plus 6.0 图像处理软件对5-HT的阳性表达情况进行分析，取其平均光密度值判断5-HT的阳性表达。5-HT受体蛋白定位于细胞膜部位，阳性细胞显示棕黄色。

1.7统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组学习记忆成绩 M组与NC组比较学习和记忆能力降低，表现为学会空间分辨所需训练次数显著增高(P<0.01)；与M组相比，NM、NH组训练次数显著减少(P<0.01)；NL组与M组学习记忆能力无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.2海马组织中H2S含量变化 M组与NC组相比，海马组织内H2S含量明显增高(P<0.01)；NL组与M组比较，海马组织内H2S差异无统计学意义(P>0.05)；NM、NH组与M组相比，海马组织中H2S含量均显著降低(P<0.01)。见表1。

2.3光镜观察海马组织中5-HT受体蛋白表达 各组海马CA1、CA3区均可见一定量5-HT受体阳性表达，阳性反应细胞着色较深，呈棕黄色。与NC组相比，其余4组5-HT受体阳性表达量明显降低(P<0.01)，其中M组降低最明显。NM、NH组与M组比较，5-HT受体阳性表达明显升高(P<0.01)；NL组与M组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1。

表1 各组学习记忆能力、海马组织H2S含量、CA1、CA3区阳性细胞平均光密度值比较

与NC组比较：1)P<0.01；与M组比较：2)P<0.01

图1 各组海马CA1、CA3区免疫组化染色阳性细胞(×400)

3 讨 论

长期过量饮酒是心脑血管疾病的独立危险因素，慢性酒精中毒可以对中枢神经系统的正常功能造成严重损害，引起学习记忆方面的认知功能障碍〔1〕。本研究提示，NBP能减轻慢性酒精中毒大鼠所致的记忆力下降，提高学习记忆能力。

H2S是新发现的一种气体信号分子，脑内含硫氨基酸代谢生成半胱氨酸，之后经酶的催化作用生成H2S。有研究〔5〕发现H2S通过提高谷胱甘肽含量激活Cl-通道及增强谷氨酸摄取，生理浓度的H2S可调节突触传递，能够对神经系统中的多种氧化性物质及时清除，进而减轻氧化损伤〔6〕。而高浓度的内源性H2S会通过抑制细胞色素C氧化酶来抑制细胞的呼吸活动，进而损害神经细胞〔7〕。胱硫醚-β-合成酶(CBS)是参与内源性H2S合成过程的重要酶之一，它主要分布于海马、脑干、皮层等结构中。慢性酒精摄入可以使海马区中N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)表达上调〔8〕，导致Ca2+大量内流，激活钙离子/钙调蛋白介导信号转导途径，进而激活CBS，增加内源性H2S的合成表达。慢性酒精中毒导致线粒体肿胀，正常功能受限，H2S含量增加、乙醛毒性与线粒体功能障碍引发脱髓鞘病变〔9〕密切相关，使信息在海马各区之间的突触环路传导受到阻滞，导致学习记忆能力的降低。本研究提示，通过药物干预影响内源性H2S的表达量可能为NBP治疗慢性酒精中毒的机制之一 。

5-HT作为参与学习记忆调控的一种单胺类神经递质，可以促进脑皮层和海马区神经细胞的分化，参与海马区主管的认知过程〔10〕。已有明确证据表明5-HT对酒精中毒有影响并且乙醇处理导致大鼠脑中5-HT能体系5-HT转运体(SERT)和5-HT表达降低〔11〕。酒精可以刺激5-HT系统，增加5-HT能神经元的放电频率，引起情绪差、冲动攻击、对酒精反应降低等症状。5-HT神经元产生于中脑神经核，是慢性酒精中毒最主要的解剖基础。酒精所致的欣快感与中脑边缘多巴胺系统的功能状况上调有关，而5-HT系统可以通过对中脑边缘多巴胺系统(MLDS)的抑制作用来减轻慢性酒精中毒症状，MLDS包括伏隔核、腹侧被盖区、杏仁核、额前皮质及海马等脑区。研究表明在细胞膜上，5-HT可明显减弱谷氨酸(Glu)诱导的Ca2+内向电流，提高过量Glu作用下海马神经细胞的存活率〔11〕。本研究提示，NBP治疗慢性酒精中毒的机制之一可能与提高海马区域5-HT含量有关。

众所周知，海马是一个与学习记忆功能及情感等高级神经活动密切相关的重要结构，在海马内部存在着明确的突触通路。Papez 环路和三突触环路〔12〕是与海马紧密相关的两大通路。前者以海马为中心环节，将丘脑乳头体、丘脑前核、扣带回及海马联系在一起，使冲动在回路中循环往复，形成短时记忆的基础。后者则由内嗅皮层发出穿通纤维至齿状回颗粒细胞，接着经苔藓纤维将冲动传至CA3区锥体细胞层，再经由CA3区发出的Schaffer侧支将冲动送达CA1区锥体细胞层。本实验提示大鼠的学习记忆功能可能与海马CA1和CA3区5-HT受体蛋白的表达有关。综上，H2S作为一种重要的神经递质，在慢性酒精中毒中发挥重要作用，酒精可导致NMDAR上调，受体门控钙通道开放，Ca2+内流增多，导致内源性H2S生成量增加。超过生理浓度的内源性H2S通过增强NMDAR介导的钙超载，造成线粒体肿胀损伤，引起能量代谢障碍，最终导致神经细胞的死亡〔13〕。用乙醇处理过的大鼠，脑部5-HT能体系被抑制且5-HT表达降低，而5-HT系统可以通过对MLDS的抑制作用来减少酒精中毒症状，并且一定浓度的5-HT可减弱Glu诱导的Ca2+内向电流，借此减轻过量Glu神经毒性的作用〔11〕。本研究提示，NBP对慢性酒精中毒症状的改善可能是影响海马内H2S及CA1、CA3区5-HT表达量的结果。