肝癌组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3、mTOR的表达及意义

李 芳 徐 萍 高婷婷 陈 伟

(江苏医药职业学院，江苏 盐城 224005)

肝癌居我国恶性肿瘤发病率第四位，死亡率居第二位〔1〕。目前对于肝癌的发生发展机制研究有限。自噬作为真核生物独有的生命现象与多种癌症的发生发展有关，但与肝癌的关系尚不清楚〔2〕。自噬相关基因Beclin1参与磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合物和自噬体的组成，在调节自噬活性参与肿瘤发生发展中起重要作用。微管相关蛋白1轻链(LC)3是酵母Atg8基因的同源基因，其表达水平与自噬活性有关，可作为自噬的特异性诊断指标之一〔3〕。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K家族成员，与细胞增殖、肿瘤血管的形成明切相关，在肿瘤细胞中常呈高表达〔4〕。本研究分析自噬相关蛋白Beclin1、LC3、mTOR在肝癌中的表达情况及其与患者临床病理指标的关系。

1 资料与方法

1.1样本来源 2015年4月至2017年10月于盐城市第一人民医院手术切除的肝癌组织49例，由两位病理医生经双盲法重新阅片诊断，均经病理切片HE染色确诊为肝癌。纳入标准：①结合临床症状和体征、腹部CT、MRI、实验室检查等确诊为原发性肝癌，并符合《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》〔5〕中的相关诊断标准。②所有病例为首次发现，术前未行放、化疗及其他生物免疫治疗。排除标准：①肾功能障碍者；②合并严重免疫系统疾病；③合并其他恶性肿瘤；④合并全身严重感染患者。其中男38例，女11例；年龄35～78(中位62)岁；按Edmondson分级标准：Ⅰ级7例，Ⅱ级10例，Ⅲ级22例，Ⅳ级10例。肿瘤直径> 5 cm者29例，≤5 cm者20例；乙肝表面抗原(HBSAg)阳性者36例；甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L者26例；中、高分化者13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者39例；病理分级Ⅰ～Ⅱ级者17例；有转移者10例；有胆管癌栓者9例。另选取癌旁5 cm外正常肝组织38例作为对照组。

1.2试剂材料 Beclin1、mTOR兔多克隆抗体均购自Abcam公司，兔LC3多克隆抗体、通用型免疫组织化学技术检测试剂盒、柠檬酸及二氨基联苯胺(DAB)显色液均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3研究方法 (1)采用SP免疫组织化学技术，操作严格按照说明书进行。主要包括：石蜡切片脱蜡后用胰酶抗原修复，滴加过氧化酶阻断液封闭10 min，后用10%非免疫动物血清孵育40 min。滴加Beclin1抗体、LC3抗体或mTOR抗体于4℃过夜。随后用鼠抗兔二抗孵育20 min，DAB显色。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，用已知的肝癌阳性片为对照。(2)Beclin1、LC3和mTOR均以细胞膜和(或)细胞质染为淡黄、棕黄或棕褐色为阳性。采用染色强度和阳性细胞百分率相结合来判定。染色强度：无着色为0分，淡黄色1分，棕黄色2分，褐色3分。阳性细胞百分比：<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，>50%者计3分。两者相乘为总分，≥4分计为免疫组织化学阳性(+)，<4分为阴性(-)。

1.4统计学方法 使用SPSS17.0统计软件进行Spearman等级分析及χ2检验。

2 结 果

2.1肝癌组织和正常肝组织中Beclin1、LC3和mTOR表达比较 Beclin1、LC3和mTOR主要表达于肝癌细胞的细胞质中，为黄色或者棕黄色颗粒，在正常肝组织中多为阴性。肝癌组织标本中，Beclin1、LC3、、mTOR阳性表达率〔37例(75.5%)、31例(63.3%)、23例(46.9%)〕均明显高于癌旁组织〔9例(23.7%)、13例(34.2%)、10例(26.3%)，χ2=56.092、45.263、53.240，P=0.000、0.010、0.074〕。

2.2肝癌组织中Beclin1、LC3和mTOR阳性表达与临床病理特征的关系 Beclin1、LC3和mTOR的阳性表达仅与病理分级和有无胆管癌栓有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、HBSAg、AFP、分化程度、TNM分期、是否转移等均无关(P>0.05)。见表1。

表1 Beclin1、LC3和mTOR阳性表达与临床病理特征的关系

2.3肝癌组织中Beclin1、LC3和mTOR表达相关性 肝癌组织中Beclin1与LC3的表达呈正相关(r=0.578,P<0.01)，LC3与mTOR的表达呈负相关(r=-0.403,P<0.05)，而Beclin1与mTOR的表达无关(r=-0.113,P>0.05)。

3 讨 论

自噬是真核细胞的程序性死亡，是体内多余的蛋白质、细胞器等亚细胞成分在体内分解代谢的过程〔6〕。研究发现，自噬不仅可以通过清除受损细胞器、抑制细胞生长、启动细胞程序性死亡等过程来抑制肿瘤细胞增殖，且在饥饿、缺氧等病理生理状态下还可能通过诱发自噬来增强肿瘤细胞的耐受性，从而促进肿瘤发生〔7〕。肝癌是高度缺氧、缺血的实体肿瘤，推测自噬在肝癌的发生、发展中扮演了一定角色。

Beclin1基因是哺乳动物酵母ATG6基因的同源基因，余招焱等〔8〕研究也报道在胃癌组织中Beclin1的表达显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。通常认为Beclin1是一种肿瘤抑制基因，但本研究结果显示Beclin1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，同时Beclin1蛋白仅与病理分级和有无胆管癌栓有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径、HBSAg、AFP、分化程度、TNM分期、是否转移等均无关。分析认为，高病理分级及胆管癌栓可能造成肿瘤的缺血、缺氧状态，而自噬可减轻肿瘤的缺血、缺氧状态，增强肿瘤的耐受性及抵御不良生存环境的能力。段昌虎等〔9〕研究也表明，Beclin1在肝癌组织中呈高表达，提示Beclin1在肝癌发生发展中的作用有重要意义，可能有助于疾病的诊断及靶向治疗。

LC3基因主要有Ⅰ型与Ⅱ型两种形式。LC3Ⅱ是LC3Ⅰ经过泛素样加工后的蛋白水解衍生物，主要参与自噬泡及自噬体的形成，是自噬体的标志分子〔3〕。但是LC3的表达与肿瘤发生、发展的关系还存在争议。韩冰等〔10〕报道在口腔鳞癌中LC3阳性率为29%，显著低于正常黏膜组95%，而Othman等〔11〕则发现LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在乳腺癌中的表达显著高于正常组织。本研究结果显示，LC3在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，说明LC3存在上调和下调两种机制，在不同类型的肿瘤中发病机制不同，其分子机制还有待进一步探究。

mTOR是一种进化上保守的蛋白激酶，参与多种信号通路，在肿瘤中常高表达，其活化可以促进细胞周期的进展、血管增殖，从而促进肿瘤的形成。有研究表明，mTOR乳腺癌、小细胞肺癌、白血病等多重肿瘤中均存在高表达〔12～14〕。李帅帅等〔15〕研究也表明，mTOR参与人肝癌细胞BEL-7402中的Cox-2的表达，从而促进细胞增殖、抑制凋亡、促进肿瘤血管的生成等。本研究结果也显示，mTOR在肝癌组织中表达的阳性率高于正常组织，说明肝癌组织中存在mTOR的异常激活，在肝癌的发生、发展中起到了重要作用。

本研究分析肝癌组织中Beclin1、LC3和mTOR表达的相关性，结果说明Beclin1过表达能促进肝癌细胞的自噬，而mTOR的过表达能抑制自噬，二者可能通过不同的信号通路调节自噬。自噬调控途径中Ⅰ型PI3K与Ⅲ型PI3K发挥重要作用。Beclin1基因通过与Ⅲ型PI3K和VPS15的结合，调节PI3K的活性，促进自噬作用，而mTOR则接受上游的Ⅰ型PI3K信号通路的调控，磷酸化下游的两个分子即4E-BP1和S6K1，来抑制自噬的发生〔16〕。

本研究初步揭示肝癌中自噬相关基因Beclin1、LC3和mTOR的表达情况，为进一步研究肿瘤自噬活性调节的分子机制及肿瘤的发生、发展过程提供了重要方法及途径。