超高压均质对紫苏油纳米乳液稳定性的影响

李 杨 胡 淼 谢凤英,2 齐宝坤 孙禹凡

(1.东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030； 2.哈尔滨市食品产业研究院， 哈尔滨 150028)

0 引言

紫苏是唇形科一年生草本植物，多种植于亚洲国家[1]。紫苏籽中含有35%～45%的油脂，90%为不饱和脂肪酸，其中α-亚麻酸的质量分数为52.58%～61.98%。同时，紫苏油中含有18种氨基酸，必需氨基酸的含量较高，其中赖氨酸和甲硫氨酸明显高于小麦、玉米等常见经济植物[2]。有研究表明[3-4]，紫苏油具有降血脂、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、增强记忆力等功效。由于紫苏油几乎不溶于水，其生物利用率较低，且紫苏油中的主要活性物质是不饱和脂肪酸，结构中含有双键，导致其不稳定极易发生氧化酸败，尤其环境因素(温度、光照、催化剂等)会加剧不饱和脂肪酸氧化的过程[5-6]。目前主要通过添加人工抗氧化剂或制备成软胶囊防止紫苏油氧化，提高其生物利用率，而人工抗氧化剂具有一定的毒副作用，软胶囊的粒径较大，吸收效率较低，未能达到所期望的效果。吴旭锦[2]利用有机小分子表面活性剂(吐温80)制备紫苏油纳米乳液，与传统的紫苏油相比可以提高紫苏油降低血脂的能力，但是有机小分子表面活性剂对人体健康有一定的影响，因此开发一种新的表面活性剂来稳定紫苏油纳米乳液具有重要的意义。

大豆分离蛋白(Soy bean protein isolate, SPI)因其具有多种功能特性而在食品工业中得以广泛的应用，其中乳化性是较为重要的功能特性，而单一的SPI由于受到结构影响，容易变质，限制了其在食品工业中作为乳化剂的应用[7]。卵磷脂是一种双亲性的小分子表面活性剂，易在油水界展开，可降低表面张力。BECKWITH[8]、NIEUWENHUYZEN等[9]研究发现，大豆蛋白与卵磷脂之间通过静电作用和疏水作用产生交互作用。有研究表明[10-11]，在乳液中添加磷脂酰胆碱可以提高乳液的乳化活性和乳化稳定性。同时利用超高压均质技术的空穴效应可以使蛋白的结构发生变化，使乳液的粒径降低，形成纳米乳液(粒径10～500 nm)，提高乳液的稳定性。

目前，鲜有人研究利用超高压均质技术，以SPI、磷脂酰胆碱作为表面活性剂制备紫苏油纳米乳液技术及其相关性质。由于纳米乳液具有粒径小、性质稳定等特点，将紫苏油制成纳米乳液不仅可以延长紫苏油氧化变质的时间，同时还可以增大紫苏油在人体内的生物利用率，促进紫苏油在人体内的消化吸收。

本文以SPI、大豆卵磷脂作为表面活性剂，以紫苏油作为油相，采用超高压均质技术制备紫苏油纳米乳液，探究不同SPI质量分数和超高压均质压力对紫苏油纳米乳液稳定性的影响，以期为工业生产提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白603，上海贺普实业有限公司；紫苏油，哈尔滨普润油脂有限公司；磷脂酰胆碱，北京索莱宝科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，北京新光化工试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Mastersizer 2000型粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机，上海市离心机械研究所；FB-110T型超高压均质机，上海励途机械设备工程有限公司；UTL2000型乳化机，德国 IKA仪器设备公司；TURBISCAN型稳定性分析仪，北京朗迪森科技有限公司；J-810型圆二色谱仪，日本Jasco公司。

1.3 紫苏油纳米乳液的制备

将不同浓度的大豆分离蛋白(质量分数2%、3%、4%)溶液与磷脂酰胆碱在室温(25℃)下搅拌2 h，使大豆分离蛋白与磷脂酰胆碱充分溶解并发生相互作用，在终溶液中加入5%的紫苏油，采用乳化机在20 000 r/min下乳化3 min，得到粗乳液，之后在不同的高压均质压力(100、120、140 MPa)下进行再次乳化，其中高压均质的次数为2次。

1.4 平均粒径、PDI值及Zeta电位

采用Mastersizer 2000型粒度仪测定紫苏油纳米乳液的平均粒径、PDI值和Zeta电位。将不同条件下制备的紫苏油纳米乳液稀释2 000倍，其中颗粒折射率为1.46，分散剂折射率为1.33，吸收参数为0.001[12]，测定温度为25℃，平衡时间为2 min，计算3次重复试验得到的平均值。

1.5 物理稳定性

参照吕长鑫等[13]的方法，将被测样品放入样品池中，采用近红外光作为光源，在室温下，使用探头从样品池的底部到样品池的顶部每隔1 min测量一次，从底部到顶部的一次测量成为一次扫描，新鲜的紫苏油纳米乳液扫描30 min, 放置21 d 后的紫苏油纳米乳液重新扫描30 min。由于紫苏油纳米乳液外观不透明，本研究只讨论背散射光特征随时间的变化情况，分析紫苏油纳米乳液的物理稳定性。

1.6 储藏稳定性

紫苏油纳米乳液在常温下储藏，每隔5 d测定纳米乳液的平均粒径，持续观察21 d，具体步骤如下：将紫苏油纳米乳液用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH值7.5)稀释2 000倍，用Mastersizer 2000型粒度仪测定，其中颗粒折射率为1.46，分散剂折射率为1.33，吸收参数为0.001[12]，测定温度为25℃，平衡时间为2 min。

1.7 圆二色谱

新鲜的紫苏油纳米乳液在10 000g、室温下离心30 min，取出上层的乳化层，将乳化层与冷冻的丙酮(按液料比20 mL/g)在-18℃下反应2 h，离心分离(10 000g，15 min，4℃)得到沉淀的蛋白，之后用丙酮清洗5～6次，最后得到的蛋白沉淀进行冷冻干燥，得到界面蛋白的粉末。

利用圆二色谱测定界面蛋白二级结构的变化，将样品溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液中(pH值7.4)，并用去离子水将样品浓度稀释到0.5 mol/L，25℃下，以100 nm/min 扫描速率在190～260 nm范围内扫描，样品池光程为1 mm，分辨率0.1 nm。采用CDPro曲线拟合软件对数据处理分析求得二级结构相对含量，每组样品重复测定 3 次。

1.8 数据分析

采用SSPS 20.0软件对数据进行处理，所有试验均为3次重复试验，用 Origin 8.5 软件绘制趋势曲线图。

2 结果与分析

2.1 纳米乳液的粒径及PDI值

由图1a可知，随着均质压力和SPI质量分数的增加，纳米乳液的平均粒径逐渐降低，当均质压力为140 MPa、SPI质量分数为4%时，纳米乳液的平均粒径最小为241.03 nm。图1b为纳米乳液的PDI值，PDI值表征聚合物的分子量分布，PDI值越小表示乳液分布得越均匀，由图1b可知，在140 MPa、SPI质量分数4%条件下纳米乳液的PDI值达到最低。PATIL等[14]、DEY等[15]的研究结果发现，随着表面活性剂浓度的增加，纳米乳液的平均粒径逐渐降低，这些结果与本文的试验结果相似。研究表明大豆分离蛋白具有良好的表面活性[16]，以大豆分离蛋白作为纳米乳液的表面活性剂可以降低油水界面的界面张力，并且随着浓度的增加，大豆分离蛋白能够紧密包裹在油滴的表面，防止油滴发生聚合现象，增强油滴的稳定性；纳米乳液中的紫苏油与原紫苏油相比，表面积增加，不仅可以防止紫苏油氧化，同时也可以增加紫苏油的生物利用率[17]。

图1 紫苏油纳米乳液的平均粒径及PDI值 Fig.1 Average particle size and PDI value of perilla oil nanoemulsion 注：图中不同字母表示差异显著，下同。

2.2 纳米乳液的ζ-电位

图2 紫苏油纳米乳液的ζ-电位 Fig.2 Zeta-potential of perilla oil nanoemulsion

ζ-电位是用来表征油滴之间静电斥力的一种方法。从理论上来说，ζ-电位的绝对值小于30 mV，表明乳液的稳定性较弱，而ζ-电位的绝对值大于30 mV，表明乳液的稳定性较强[18]。图2所示为紫苏油纳米乳液的ζ-电位，由图2可知，随着SPI质量分数和高压均质压力的增加，紫苏油纳米乳液的ζ-电位逐渐降低，其中在SPI质量分数4%、均质压力140 MPa下紫苏油纳米乳液的ζ-电位最低，表明在此条件下紫苏油纳米乳液表面有较多的同种电荷，彼此之间有较高的静电斥力，防止液滴发生聚合，因此在此条件下紫苏油纳米乳液有较高的稳定性。但所有条件下制备的紫苏油纳米乳液的ζ-电位绝对值均低于25 mV，SALVIA-TRUJILLO[19]等探究不同精油纳米乳液的稳定性和抗菌特性时，表明不同精油纳米乳液的ζ-电位绝对值均低于30 mV，DEY等[15]也报道了利用芝麻分离蛋白制备的纳米乳液的ζ-电位在(-11.98±0.598)mV，绝对值低于30 mV。这可能是由于不同油脂之间的离子组成以及分散的水平不同所导致的[20]。

2.3 物理稳定性

图3 紫苏油纳米乳液的物理稳定性 Fig.3 Physical stability of perilla oil nanoemulsions

利用Turbiscan稳定性分析仪测定紫苏油纳米乳液的物理稳定性。Turbiscan稳定性分析采用880 nm近红外光源，由于紫苏油纳米乳液属于不透明液体，因此只需检测样品的背散射光强度的变化率(BS)，来反映样品的稳定性[13]。Turbiscan稳定性分析扫描的范围为0～40 mm，其中左边为样品的底部，右边为样品的顶部，左边曲线向上移动表明样品发生沉淀，右边曲线向上移动表明脂肪上浮，中间的曲线发生波动则表明有聚合现象[21]。图3、4为不同的SPI质量分数和超高压均质压力对紫苏油纳米乳液物理稳定性的影响，其中图3为新制备的紫苏油纳米乳液Turbiscan稳定性分析结果，从图3可以看出所有样品左边曲线未出现向上移动的现象，说明样品没有发生沉淀；中间的曲线比较平缓并且无异常的波动，样品比较均匀未发生聚合现象；右边曲线未向上移动，表明无脂肪析出，综上所述，新制备的紫苏油纳米乳液具有较强的稳定性，未出现沉淀、脂肪上浮、聚合等现象。图4为紫苏油纳米乳液在室温下放置21 d后紫苏油纳米乳液的稳定性分析结果，从图4可以看出，不同SPI质量分数和超高压均质压力下制备的紫苏油纳米乳液在曲线的左侧未向上移动，中间曲线也无波动现象，表明乳液未发生聚合和沉淀现象；而在右侧曲线部分，除了图4g～4i以外，其他图中均出现了曲线上移的现象，说明有脂肪析出的现象，这可能是由于SPI的质量分数较低，未能将油滴完全包裹，而使油滴发生聚合，出现脂肪上浮的现象。而在图4g～4i中，图4i的曲线最稳定，图4i为4% SPI、140 MPa下制备的紫苏油纳米乳液，表明在这一条件下制备的紫苏油纳米乳液具有较强的稳定性，这说明在140 MPa的高压均质下，4%的SPI能够较好地覆盖在油滴的表面，防止油滴发生聚集[22]。2.1节、2.2节的结果也证明了此结论。

图4 紫苏油纳米乳液室温下放置21 d后的物理稳定性 Fig.4 Physical stability of perilla oil nanoemulsions after 21 d

图5 紫苏油纳米乳液的储藏稳定性 Fig.5 Storage stability of perilla oil nanoemulsions

2.4 储藏稳定性

图5为不同条件下制备的紫苏油纳米乳液在室温下储藏的平均粒径的变化。由图5可知，所有的紫苏油纳米乳液的样品在前16 d的平均粒径无明显的变化，与新制备的紫苏油纳米乳液平均粒径相近。而在第21天时，紫苏油纳米乳液的粒径明显增加。图5a为在2%SPI条件下，不同高压均质压力下紫苏油纳米乳液平均粒径的变化，由图可知，紫苏油纳米乳液在21 d时，平均粒径增加至400 nm以上；图5b为在3% SPI条件下，不同高压均质压力下紫苏油纳米乳液平均粒径的变化，由图可知，紫苏油纳米乳液在21 d时，平均粒径明显的增加，但平均粒径低于2%条件下的紫苏油纳米乳液,产生此现象的原因可能是SPI的质量分数较低，不能将油滴完全包裹，油滴之间发生聚合，本文中2.3节的物理稳定性也表明在储藏21 d后紫苏油纳米乳液出现脂肪析出现象，图5c为在4% SPI条件下，不同高压均质压力下紫苏油纳米乳液平均粒径变化, 由图可知，在140 MPa下紫苏油纳米乳液的平均粒径与新鲜的紫苏油纳米乳液平均粒径相当，这说明在此条件下，纳米乳液具有较好的物理稳定性和储藏稳定性，这可能是由于高压均质产生的压力作用、高频振荡和对流撞击等机械力诱导蛋白质结构发生改变，使蛋白更容易吸附在油水界面，形成均一稳定的紫苏油纳米乳液[23]。

2.5 圆二色谱

圆二色谱是一种精准分析蛋白质二级结构的常用手段，能够在蛋白液体中直接测定[24]。本文选择能够反映肽键圆二色性的远紫外区(190～260 nm)光谱条件，对不同条件的紫苏油纳米乳液中界面蛋白二级结构进行分析。图6为紫苏油纳米乳液中界面蛋白的圆二图谱，表1为不同条件下紫苏油纳米乳液中界面蛋白二级结构相对含量变化。经超高压均质后，界面蛋白的结构发生了明显的变化，从表1可知，界面蛋白中的α-螺旋相对含量较低，β-折叠和无规卷曲的相对含量较高，其中界面蛋白中的二级结构主要以无规卷曲为主。这可能是由于磷脂酰胆碱与SPI中的α-螺旋结构结合。增加高压均质的压力α-螺旋结构相对含量降低，这可能是高压均质产生的压力作用、高频振荡和对流撞击等机械力诱导蛋白质结构发生改变，从而改变界面蛋白在油滴表面的分布，进而影响紫苏油纳米乳液的稳定性。高压均质改变蛋白的结构，使得蛋白-磷脂酰胆碱具有较好的均匀性和较强的乳化性，增强紫苏油纳米乳液的稳定性[25]。

图6 紫苏油纳米乳液界面蛋白圆二色谱 Fig.6 Circular dichroism spectrum of perilla oil nanoemulsions

均质压力/MPaSPI质量分数/%相对含量/%α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲1002(7.8±0.8)a(32.2±0.8)a(18.1±0.3)c(40.9±0.2)b3(7.5±0.2)a(28.0±0.9)c(21.4±0.4)a(43.2±0.3)a4(7.3±0.3)b(33.0±0.0)a(18.1±0.6)b(41.6±0.5)b1202(6.8±0.6)c(31.9±0.2)a(19.0±0.5)b(42.3±0.4)b3(6.6±0.2)c(32.0±0.3)a(19.0±0.3)b(42.5±0.3)b4(6.7±0.1)c(36.3±0.5)a(17.2±0.6)c(39.8±0.2)d1402(5.9±0.4)d(28.8±0.4)c(21.2±0.5)a(44.1±0.1)a3(5.6±0.6)d(34.1±0.1)b(17.4±0.4)c(42.9±0.5)a4(5.7±0.4)d(34.2±0.2)b(16.6±0.1)d(43.5±0.4)a

注：同列不同小写字母表示差异显著。

3 结束语

以SPI-磷脂酰胆碱为表面活性剂，利用超高压均质技术制备紫苏油纳米乳液，研究紫苏油纳米乳液的稳定性，得出以下结论：不同SPI质量分数和超高压均质压力对紫苏油纳米乳液的稳定性具有一定的影响，随着SPI质量分数和超高压均质压力的增加，紫苏油纳米乳液的稳定性逐渐增加；超高压均质通过改变紫苏油纳米乳液中界面蛋白的结构来影响紫苏油纳米乳液的稳定性。