红肉火龙果采后病原菌分离鉴定与植物精油抑菌研究

刘瑞玲 郜海燕 陈杭君 房祥军 吴伟杰

(1.浙江省农业科学院食品科学研究所， 杭州 310021； 2.农业部果品产后处理重点实验室， 杭州 310021； 3.浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室， 杭州 310021； 4.中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室， 杭州 310021)

0 引言

火龙果是仙人掌科量天尺属，属典型的热带植物。火龙果风味独特，含有丰富的维生素、甜菜苷以及水溶性膳食纤维[1]，具有降血脂、养颜减肥、抗氧化和防衰老等功效[2-4]。按果皮和果肉颜色，火龙果可分为红皮白肉、红皮红肉、黄皮白肉3类[5]。近年来，随着温室技术的发展，浙江地区已有一定规模的种植面积，其中以红肉火龙果为主。红肉火龙果色泽鲜艳、肉质细嫩、鲜食品质较好，富含甜菜碱，营养价值高。但其含水率高、果皮较薄，采后极易失水皱缩或腐烂，使其耐贮藏性比白肉火龙果差。火龙果采后病害将造成巨大经济损失，已成为制约浙江种植区产业发展的主要问题。

研究表明，火龙果采后主要病害是炭疽病、黑斑病和软腐病等[6]。有关火龙果果实采后病原菌分离鉴定的研究已有一些报道，MA等[7]研究表明，镰刀菌(Fusariumspp.)和链格孢菌(Alternariaspp.)是上海市进口火龙果的主要采后病原菌。GUO等[8]鉴定，引起云南省火龙果果实炭疽病的主要病害为平头炭疽菌(C.truncatum)。姚昇华等[9]认为，仙人掌平脐蠕孢(Bipolariscactivora)是引起越南红心火龙果黑腐病的主要致病菌。然而，浙江地区主栽火龙果品种的采后病原菌种类和防治方法未见相关报道。因此，分离和鉴定浙江红肉火龙果采后主要致病菌，对减少采后物流损失、增加经济效益具有重要意义。

目前，国内外火龙果保鲜的方法主要有低温贮藏、减压贮藏、热处理、辐照处理等物理保鲜技术，以及使用1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)、CaCl2、壳聚糖等防腐保鲜剂的化学保鲜技术[6, 10-13]。化学杀菌剂虽是防治果蔬采后病害的重要手段，但具有残留量高、污染环境、易使病原菌产生抗药性等负面效应，不宜长期使用。植物精油以其安全、低毒、高效、环境友好等特点作为化学保鲜剂的良好替代品，是一种极具潜力的天然杀菌剂[14-15]。植物精油(如香芹酚、肉桂醛、麝香草酚、AITC等)对多种果蔬釆后病原菌有较强的抑制作用，能够减缓采后病害的发生[16-17]。植物精油对火龙果采后病原菌抑制效果研究，至今未见文献报道。

本文对浙江地区红肉火龙果果实采后低温贮藏过程中的病原菌进行分离纯化，并对其进行形态学和分子生物学鉴定。同时，采用体外直接接触和体外熏蒸试验，比较6种植物精油对火龙果采后主要病原菌的抑菌效果，以筛选出抑菌效果较好的精油，旨在为火龙果采后病害控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

果实：红肉火龙果，2017年7月21日采自浙江省杭州市火龙果基地，并用保鲜车24 h内运至实验室。挑选颜色均匀、无病虫害、无机械损伤的果实于(7±1)℃冷库中贮藏，待自然发病后进行病原菌的分离鉴定。

试剂：肉桂精油、百里香精油、香芹酚精油、丁香精油、罗勒精油和芳樟醇均为单方精油，购自江西金源天然香料有限公司；无水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、葡萄糖、琼脂粉，均为分析纯，购于浙江常青化工厂；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)购于上海盛思生物科技有限公司；DNA植物kit基因组织提取试剂盒购于TaKaRa Bio有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。

仪器： MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器(松下健康医疗器械株式会社)；台式高速低温冷冻离心机(美国Thermo公司)；DYY-11型电泳仪电源和DYCP-31F型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Peltier Thermal Cycler MG48型普通PCR仪(美国BioRad公司)；WD-9413C型凝胶成像分析系统(北京六一生物科技有限公司)；MJX-160B-Z型霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 试验方法

1.2.1病原菌的分离纯化

将自然发病的火龙果果实按病症分组。首先用灭菌的手术刀在病健交界处切取约3 mm的组织块，经75%酒精表面消毒30 s，用无菌水清洗3次，置于PDA培养基平板上，每一病症组5个平板，于25℃恒温培养箱中暗培养。待菌落直径生长至1～3 cm时，用灭菌的接种针挑取菌落边缘的菌丝，置于新的PDA培养基，于25℃恒温培养箱中暗培养，重复上述操作3～5次，直至获得纯培养物。观察记录菌落形态学特征，并对病原菌孢子和菌丝进行显微形态观察、拍照。将纯化后病原菌接种PDA培养基上，培养一段时间后，观察菌落培养性状，包括菌落的形状和颜色；挑取病原菌制作载玻片，镜检并观察分生孢子的类型、形状、大小和色泽等。

本试验分离的菌均为真菌，根据各致病菌株PDA培养基上的菌落形态、菌丝和孢子的特征，参照文献[18]进行鉴定。

1.2.2病原菌的致病性检测

按照柯赫法则进行致病性检测。采用无菌水洗脱纯化培养的菌株，收集孢子，利用血球计数板配制成孢子浓度为105CFU/mL的悬浮液。挑选健康火龙果果实，先用清水洗净，再用75%乙醇对果实表面进行消毒，然后用2%的次氯酸钠浸泡2 min后，再用无菌水冲洗2遍，晾干备用。接种时用消毒接种针在果实赤道部刺伤(直径约3 mm，深度约4 mm)，分别接种10 μL孢子悬浮液，以接种无菌水的果实作为对照。将以上处理果实放置于尺寸(长×宽×高)400 mm×300 mm×150 mm的塑料筐中，贮藏于25℃，保持相对湿度约95%。定期观察发病情况，显现病症后再次分离鉴定。将分离出的菌株与所接菌株的菌落形态及菌丝形态进行比较，以判断是否一致。

1.2.3病原菌分子生物学鉴定

(1)病原菌基因组DNA提取

以分离得到的病原菌为材料，挑取少量菌丝，转接到50 mL马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)培养液中，25℃、150 r/min培养4～5 d后，用无菌滤纸过滤获得菌丝体，再用无菌水冲洗3～5次，收集菌丝，采用改良的CTAB法提取病原菌基因组DNA[19]。

(2)病原菌rDNA-ITS序列扩增

采用真菌核糖体rDNA转录间隔区(ITS)的通用引物ITS1和ITS4[20]，对提取的基因组DNA进行PCR扩增，序列如下：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGC-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反应体系(20 μL)：双蒸水7.4 μL、2×ES Taq Master Mix 10 μL、ITS1(10 μmol/L)0.8 μL、ITS4(10 μmol/L)0.8 μL、模板DNA 1 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s、53℃退火1 min、72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。4℃下保存。

上述扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，切下凝胶中的目的片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)进行目的片段回收。回收的DNA片段送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

(3)病原菌18S rDNA序列分析及进化树构建

测序结果经BLAST与NCBI数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已知序列进行同源性比较，根据同源性比较结果，结合形态学特征，鉴定出病原菌。同时，选取与病原菌ITS序列同源性高的序列，使用MEGA 5.1软件[21]中的Neighbor-Joining(NJ)方法构建系统发育树，并用Bootstrap进行自举检验，500次重复。

1.2.4植物精油对病原菌的抑制效果

(1)体外直接接触法

将精油分别溶于10%吐温-20中充分乳化。待融化的PDA培养基冷却到50℃左右，加入一定体积的精油悬浮液，充分振荡混合后倒平板，使平板终浓度(体积比)为125、250、500、1 000、2 000 μL/L。以不添加植物精油的培养基平板为对照。用无菌打孔器在培养7 d的病原菌平板上打取直径为6 mm菌块放在PDA平板(直径90 mm)中央。置于28℃生化培养箱中培养6 d，观察抑菌效果。采用十字交叉法测量菌落直径并计算抑制率。每个浓度梯度3个平板，试验重复3次。以抑制率100%的最低精油浓度为其最低抑菌浓度(MIC)。抑制率计算公式为

式中dC——对照菌落直径, mm

dE——处理菌落直径, mm

(2)体外滤纸熏蒸法

用无菌打孔器在培养7 d的病原菌平板上打取直径为6 mm菌块放在PDA平板(直径90 mm)中央。将平板倒置，取一片直径为6 mm的无菌滤纸片置于皿盖中央。分别吸取1、2、3、4、5 μL的精油滴于滤纸片上，以滤纸片上不添加精油的平板为对照。封口膜密封后，置于28℃生化培养箱中培养7 d，观察抑菌效果。采用十字交叉法测量菌落直径并计算抑制率。每个浓度梯度3个平板，试验重复3次。

(3)活体抑菌试验

火龙果用75%酒精进行表面消毒，晾干后，分别喷洒配制好的镰刀菌和炭疽菌孢子悬浮液(孢子浓度105CFU/mL)，分别采用精油(25 μL/L)进行密闭熏蒸处理。置于4℃贮藏，每隔4 d观察火龙果腐烂情况，并计算其腐烂率。每个处理重复2次。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0对数据统计分析，采用Duncan’s多重比较进行显著性分析，p<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离纯化结果

根据分离获得的真菌形态特征和培养性状，在罹病红肉火龙果果实上分离到6个真菌菌株，将其标记为HS1、HS2、HS3、HS4、HS5和HS6。将分离得到的菌株，依照柯赫氏法则进行回接验证，其中只有HS3和HS6两株菌株不同程度地导致果实发病。在PDA培养基上的菌落形态如图1所示：HS3菌落圆形，气生菌丝初为白色后为橘黄色，高而疏松，绒状，棉絮状；HS6菌落圆形，绒毛状，初期灰白色，后期为深灰色。菌落表面分散黑色小颗粒即分生孢子，培养后期出现橘红色孢子堆。通过显微镜观察发现，HS3大型分生孢子短，中等偏窄，两端稍尖，顶细胞弯曲，多数单个隔膜，小孢子呈椭圆形、新月形，无色透明；HS6分生孢子呈长椭圆形或一端稍窄短棒状，无色，单胞，内含数个油球(图1)。

图1 火龙果贮藏期发病果实病害症状、分离菌株 菌落特征和孢子形态 Fig.1 Diseases symptom on pitaya fruit and morphology characteristics of colonies and spores of isolated strains

根据菌落特征和孢子形态，通过与真菌鉴定手册所描述的形态比对，可将编号为HS3和HS6的真菌菌株初步鉴定为镰刀菌和炭疽菌。为了进一步鉴定这些分离到的真菌，利用PCR方法对病原菌基因组DNA进行ITS鉴定。

2.2 病原菌18S rDNA-ITS序列和系统发育树分析

以病原菌基因组DNA为模板，采用rDNA的ITS区段通用引物进行PCR扩增，两个病原菌菌株均获得1条600 bp左右的扩增条带(图2)。经回收、纯化及序列测定，HS3获得1条545 bp的单一条带，HS6获得1条574 bp的单一条带。将获得的序列在GeneBank中进行BLAST比对，菌株HS3与层生镰刀菌Fusariumproliferatum(登录号KU984710)同源性高达100%，菌株HS6与平头炭疽菌Colletotrichumfructicola(登录号MF554835)的菌株同源性高达100%。选取同源性高低不同的菌株进行多重序列比较和系统发育分析，使用MEGA 5.1软件以Neighbor-Joining法构建进化树。进化树(图3)显示，菌株HS3与Fusariumproliferatum(登录号KU984710)、Fusariumequiseti(登录号MG020725)具有很近的遗传关系，菌株HS6菌株与Colletotrichumfructicola(登录号MF554835)具有很近的遗传关系。因此，通过病原菌的形态鉴定、rDNA-ITS序列分析和系统发育树，确定引起浙江省红肉火龙果果实采后病害的主要病原菌为层生镰刀菌和平头炭疽菌。

图2 火龙果采后分离病原菌rDNA-ITS区PCR扩增 产物的电泳结果 Fig.2 Electrophoresis results on PCR products of rDNA-ITS from isolated strains

2.3 植物精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌在体外直接接触抑制效果

选择已经报道的对果蔬病原真菌有较好抑制效果的6种精油，采用体外直接接触法，研究其对火龙果釆后主要病原菌层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑菌效果。结果如表1所示，香芹酚精油、肉桂精油、百里香精油在2 000 μL/L下对两种病原菌生长的抑制率为100%，该用量下丁香精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制率分别为92.7%和83.1%，罗勒精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制率分别为65.3%和49.6%，芳樟醇对层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑菌效果不明显，抑制率分别为41.2%和43.9%。

选择抑菌效果较好的3种精油(香芹酚精油、肉桂精油、百里香精油)，进一步研究其最低抑菌浓度(MIC)。由图4可知，3种供试精油对2种病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，且随浓度升高(125～2 000 μL/L)抑菌作用逐渐增强。肉桂精油和百里香精油在浓度达到1 000 μL/L时，完全抑制层生镰刀菌和平头炭疽菌菌丝的生长；香芹酚精油表现出较强的抑菌性，当浓度增加到500 μL/L时，完全抑制层生镰刀菌菌丝的生长，在浓度为1 000 μL/L时，完全抑制平头炭疽菌菌丝的生长。另外，结果表明，在添加等量精油时，对层生镰刀菌的抑制效果好于对平头炭疽菌的抑制效果(图4)。因此，肉桂精油和百里香精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的MIC均为1 000 μL/L；香芹酚精油对层生镰刀菌的MIC为500 μL/L，对平头炭疽菌的MIC为1 000 μL/L。因此，3种精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的体外直接接触抑菌效果的优劣排序为：香芹酚、百里香、肉桂精油。

图3 基于ITS基因序列构建的病原菌HS3和HS6系统进化树 Fig.3 Molecular phylogenetic tree based on ITS sequences of HS3 and HS6

Tab.1 Inhibition effect of different plant essential oils on mycelial growth of pathogens isolated from pitaya fruit%

注：所有数据在25℃培养4 d后测得，培养基均为PDA培养基；不同字母表示差异显著(p≤0.05)，下同。

2.4 植物精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的体外熏蒸抑制效果

以体外熏蒸的抑菌试验观察香芹酚精油、肉桂精油、百里香精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制效果，其结果如图5所示，3种供试精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌均有不同程度的抑制作用，且随每张滤纸片精油添加量的增加，抑菌能力逐渐增强。当精油添加量为4 μL时，香芹酚对层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制率均为100%，肉桂精油对层生镰刀菌的抑制率为95.6%，对平头炭疽菌的抑制率为72.6%，百里香精油对层生镰刀菌的抑制率为87.9%，对平头炭疽菌的抑制率为75.8%。当精油用量为5 μL时，香芹酚和百里香精油均能完全抑制层生镰刀菌和平头炭疽菌菌丝的生长，而肉桂精油对平头炭疽菌的抑制率均仅为89.4%。因此，3种精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌的体外熏蒸抑菌效果的优劣排序为：香芹酚、肉桂精油、百里香。

2.5 植物精油对火龙果采后病原菌的抑制效果

为了进一步研究3种植物精油的活体抑菌效果，采用人工接种的方法探讨供试精油对火龙果果实致病菌的控制。由图6可知，供试精油熏蒸处理降低了接种层生镰刀菌和平头炭疽菌的火龙果低温贮藏过程中的腐烂率。接种层生镰刀菌的火龙果果实在贮藏16 d时，对照组腐烂率为44.5%，肉桂精油处理组为12.1%、百里香精油处理组为13.4%，而香芹酚处理组仅为6.7%。接种平头炭疽菌的火龙果果实在贮藏20 d时，对照组腐烂率为52.4%，肉桂精油处理组为24.8%、百里香精油处理组为35.1%，而香芹酚处理组仅为18.6%。因此，综合体外直接接触、体外熏蒸以及活体抑菌试验的结果，香芹酚精油对火龙果采后主要致病菌层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制效果最好。

图4 植物精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌体外直接接触抑制效果 Fig.4 Inhibition effect of essential oils on mycelia growth of F. proliferatum and C. fructicola in vitro

图5 植物精油对层生镰刀菌和平头炭疽菌体外熏蒸抑制效果 Fig.5 Inhibition effect of essential oils on mycelia growth of F. proliferatum and C. fructicola in vitro by fumigation

图6 植物精油对接种层生镰刀菌和平头炭疽菌火龙果低温贮藏过程中腐烂率的影响 Fig.6 Effect of essential oils on decay incidence of pitaya fruit inoculated with F. proliferatum and C. fructicola during storage at 4℃

3 讨论

通过形态学鉴定、分子鉴定和回接试验，将浙江产区红肉火龙果采后主要致病菌确定为层生镰刀菌和平头炭疽菌。层生镰刀菌是镰刀菌属的重要植物病原真菌，可侵染水稻、小麦、玉米、芦笋、大蒜、洋葱等作物[22]，引起枯萎病、腐烂病等，也有研究表明该菌是芒果畸形病的主要病原菌[23]。已有尖孢镰刀菌(F.oxysporum)[24]和单隔镰刀菌(F.dimerum)[25]被报道为引起火龙果采后病害的致病菌。其中，层生镰刀菌引起红肉火龙果贮藏病害为国内的首次报道，平头炭疽菌与朱迎迎等[26]有关海南进口火龙果的研究报道一致。

大量研究表明，植物精油大多具有杀菌、防腐等作用，能抑制果蔬采后病害的发生[12]。本文通过体外直接接触法、体外熏蒸法和活体抑菌试验，明确了香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油对火龙果采后主要致病菌层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制作用。周丹丹等[27]研究发现，丁香酚、柠檬醛和香芹酚能够抑制枇杷采后尖孢炭疽菌的菌丝生长，并抑制炭疽病的发生；李素清等[28]研究发现，肉桂精油、百里香精油、丁香精油对猕猴桃采后病原菌尖孢炭疽菌有较好抑制作用。刘继等[29]选择6种精油进行抑菌性试验，结果发现肉桂精油及百里香精油在2 000 μL/L时对生姜病原菌镰刀菌的生长抑制率均为100%，同时，肉桂精油熏蒸处理使接种镰刀菌的生姜感病率下降了59.33%。

香芹酚精油表现出较强的抑菌性，无论从直接接触还是熏蒸的方式，其对层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑菌效果均好于肉桂精油和百里香精油。直接接触方式下百里香精油的抑菌效果优于肉桂精油，熏蒸方式下，则肉桂精油的抑菌效果更好。同时，精油熏蒸处理使接种层生镰刀菌和平头炭疽菌火龙果腐烂率下降，且香芹酚精油的效果最好，活体抑菌试验则进一步证实该结果(图6)。分析其原因，是由于植物精油成分复杂，所以其抑菌机理也相对复杂，不同组分精油的抑菌作用及抑菌机制也不尽相同[30-31]。以熏蒸方式作用病原菌时，主要是精油的挥发性组分接触到菌丝；而以直接接触方式作用病原菌时，植物精油中的所有成分均可直接接触到病原菌菌丝，而肉桂精油的挥发性成分的抑菌效果优于百里香精油的挥发性成分，这可能是不同的处理方式下两种精油抑菌效果不同的原因之一。综上所述，香芹酚精油作为火龙果贮藏前的熏蒸剂有较好的应用前景。

4 结束语

经病原菌形态学和分子生物学鉴定，证实浙江省红肉火龙果采后贮藏期腐烂病害是由层生镰刀菌和平头炭疽菌两种病原真菌引起。研究结果可为研究红肉火龙果采后病害发生规律研究及进一步制定切实有效的综合防治措施提供参考依据。同时，比较了肉桂精油、百里香精油和香芹酚精油对火龙果采后主要病原菌层生镰刀菌和平头炭疽菌的抑制作用，发现香芹酚精油具有较好的抑菌效果。香芹酚精油作为火龙果贮藏前的熏蒸剂有较好的应用前景，但具体的抑菌机制仍需进一步研究。研究结果对提高火龙果贮藏品质、延长保鲜期提供了新的技术途径和理论指导。