乳腺癌组织中ALDH1及BCRP的表达状况与乳腺癌病理特征的相关性分析

梁法清 杜正贵 何阳君

[摘要] 目的 探討乳腺癌患者癌组织及腋窝淋巴结中乙醛脱氢酶1（ALDH1）以及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的表达状况与乳腺癌病理特征的关系。 方法 选取2013年1月～2016年3月在四川大学华西医院治疗的乳腺癌患者共84例，同时选取距肿瘤边缘大于1 cm正常乳腺组织（癌旁正常组织）作为对照，采用免疫组化法检测ALDH1和BCRP蛋白的表达。 结果 乳腺癌组织中ALDH1和BCRP蛋白表达率明显高于癌旁正常组织（P < 0.01）；腋窝淋巴结有转移患者癌组织中ALDH1和BCRP蛋白表达阳性率明显高于无腋窝淋巴结转移患者（P < 0.05）；雌激素受体（ER）阳性患者乳腺癌组织中BCRP蛋白表达阳性率明显高于ER阴性患者（P < 0.05）；而乳腺癌组织中ALDH1和BCRP蛋白表达与患者年龄、绝经情况、肿瘤大小、组织分级、TNM分期和孕激素受体（PR）均无相关性（P > 0.05）；乳腺癌患者ALDH1和BCRP蛋白的表达也无相关性（rs=-0.092，P > 0.05）。 结论 ALDH1和BCRP蛋白在乳腺癌发生发展中有一定作用，可能参与了肿瘤的侵袭、转移等过程。

[关键词] 乙醛脱氢酶1；乳腺癌耐药蛋白；乳腺癌；病理特征

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（b）-0076-04

The relationship between the expressions of aldehyde dehydrogenase 1， breast cancer resistance protein in breast cancer tissues and pathological features of breast cancer

LIANG Faqing1 DU Zhenggui1 HE Yangjun2

1.Department of Breast Surgery， West China Hospital of Sichuan University， Sichuan Province， Chengdu 610041， China； 2.Department of Surgery， Chengdu Seventh People′s Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610041， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between aldehyde dehydrogenase 1 （ALDH1）， breast cancer resistance protein （BCRP） expressions in tumor tissues and pathological features of breast cancer. Methods From January 2013 to March 2016， 84 patients with breast cancer in West China Hospital of Sichuan University and the normal breast tissues （adjacent tissues） which was used for control group is defined as the edge of cancer tissueedge greater than 1 cm were selected. The expression of ALDH1 and BCRP protein was detected by immunohistochemistry. Results The expression rates of ALDH1 and BCRP protein in breast cancer tissues were significantly higher than those in adjacent tissues （P < 0.01）. The positive rates of ALDH1 and BCRP protein expression in patients with axillary lymph node metastasis were significantly higher than those in patients without axillary lymph node metastasis （P < 0.05）. The positive rate of BCRP protein expression in estrogen receptor （ER） positive patients was significantly higher than that in ER negative patients （P < 0.05）. The expression of ALDH1 and BCRP protein was not correlated with age， menopause， tumor size， histological grade， TNM stage and progesterone receptor （PR） （P > 0.05）. There was no correlation between the expression of ALDH1 and BCRP protein in breast cancer （rs=-0.092， P > 0.05）. Conclusion ALDH1 and BCRP may play an important role in the development of breast cancer， which may be involved in the tumor invasion， metastasis etc.

[Key words] Aldehyde dehydrogenase 1； Breast cancer resistance protein； Breast cancer； Pathological characteristics

乳腺癌是临床上较为常见的恶性肿瘤，且近年来呈现出了明显的上升趋势，美国癌症协会报道中乳腺癌在女性新发病历中居于首位[1]。由此可见乳腺癌在人群中的疾病负担较重，因此对乳腺癌的发病机制的研究极为重要，是我们对乳腺癌预防、诊断、治疗的基石。对于乳腺癌发病及侵袭机制的研究，可以为临床上乳腺癌患者的靶向治疗提供新的靶点，并可以为乳腺癌患者的临床预后评估提供可靠的实验室指标。我们知道，一些肿瘤生物学指标可以促进癌细胞的增殖与分化，进而参与到癌症的发生、发展及侵袭转移等过程。有基础研究报道，乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）以及乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）可以通过诱导癌细胞细胞周期调控异常，提高癌组织对于抗癌药物的耐受能力，进而促进乳腺癌的发生发展[2-4]。然而，在临床研究中，ALDH1以及BCRP是否与乳腺癌的发生及疾病进展有关尚未见报道，因此，本研究将选取在四川大学华西医院（以下简称“我院”）治疗的乳腺癌患者84例，重点探讨了ALDH1和BCRP在乳腺癌患者中的异常表达，并分析其与乳腺癌患者临床病理特征间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月～2016年3月在我院治疗的乳腺癌患者84例，均为女性患者，年龄29～65岁，中位年龄50岁。纳入标准：①均接受乳腺全切手术的乳腺癌患者，术后均经病理证实为浸润性导管癌；②术前未接受放化疗等治疗；③患者及家属知情同意并签署同意书。排除标准：①临床病理资料欠缺；②术前接受放化疗等治疗；③选取的对照组标本中有肿瘤累及病例。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 染色及检测方法

1.2.1 染色方法 ①组织固定及保存：采取组织后，4%多聚甲醛中4℃固定过夜，置于70%酒精中4℃保存。②组织的包埋：将保存于4℃、70%酒精中的组织分别置于80%酒精15 min、95%酒精15 min，100%酒精15 min×2次，1/2酒精1/2透明剂60 min，透明剂60 min×2次，1/2透明剂1/2石蜡90 min，石蜡120 min×2次，将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。③切片及贴片：将包埋好的组织置于切片机上，切片厚度为3～5 μm，放于展片机中展开，将组织切片捞于多聚赖氨酸载玻片上，编号，60℃烤干1 h，贴片后60℃烤片2～3 h，后置于4℃保存。④脱蜡及脱水：先后使用使用等体积二甲苯及无水乙醇充分混合备用，脱蜡脱水时依次使用如下溶液及时间进行冲洗：二甲苯（5 min×2次）→二甲苯-无水乙醇溶液（5 min）→无水乙醇（5 min×2次）→95%乙醇（5 min）→70%乙醇（5 min）→50%乙醇（5 min）→自来水冲洗（5 min）。⑤抗原修復：将切片置入盛有10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液的容器内在微波炉内煮沸，后在亚沸腾温度下孵育10 min后流水冲洗5 min。⑥室温下使用5%山羊血清封闭切片30 min。⑦将ALDH1及BCRP抗体（鼠来源，南京碧云天生物科技有限公司）分别稀释200倍，分别采用滴染法小心添加一抗，确保待染组织被一抗染液完全包被，在室温下孵育1.5 h后转入湿盒内放入4℃冰箱内孵育过夜。⑧室温下孵育二抗1 h，酶法检测。⑨流水冲洗，脱水并封片，显微镜下放大400倍观察。OLIPICS电子显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。

1.2.2 判读标准 按切片中细胞有无显色及显色深浅进行评分，无显色为0分，浅棕色为1分，深棕色为2分。按显色细胞比例进行评分：0%～10%记0分，10%～<30%记1分，30%～<70%记2分，≥70%记3分。以上2项评分之和作为积分，按积分高低判读表达水平，0分为阴性，1～2分为低表达，3～5分为高表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH1和BCRP在乳腺癌和癌旁组织中的表达情况

乳腺癌组织ALDH1和BCRP蛋白表达率分别为70.24%和72.62%，明显高于癌旁正常组织（P < 0.01）。见表1、图1（封四）。

2.2 ALDH1、BCRP表达与病理特征关系

腋窝淋巴结有转移患者ALDH1和BCRP蛋白表达阳性率明显高于无腋窝淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P < 0.05）；ER阳性患者BCRP蛋白表达阳性率明显高于ER阴性患者，差异有统计学意义（P < 0.05）；ALDH1和BCRP蛋白表达与患者年龄、绝经情况、肿瘤大小、组织分级、TNM分期和PR无关（P > 0.05）。见表2。

2.3 相关性分析

乳腺癌患者ALDH1和BCRP蛋白表达无相关性（rs=-0.092，P > 0.05）。

3 讨论

在年龄大于35岁的育龄期女性中，乳腺癌的发病率较高，可较普通对照人群上升3～4倍[5]。特别是在具有遗传易感因素[6]、吸烟[7]及BRC1[8]基因突变等人群中，乳腺癌的发病率更高。一项临床回顾性分析研究显示，乳腺癌的5年生存率为80.60%[9]，病死率较高[1]，而通过对于乳腺癌发病过程中相关肿瘤生物学机制的研究，可以为临床上早期干预提供依据，从而改善远期生存预后。

ALDH1可以通过影响到乳清酸脱氢酶的活性，进而参与到糖代谢、三羧酸循环及氧化呼吸链传递等生理过程中，ALDH1的异常表达可以影响癌细胞葡萄糖代谢、能量利用等，进而促进癌细胞的异常分化[10-12]。基础生物学机制研究也显示，ALDH1对于下游癌基因转录蛋白的磷酸化修饰，可以提高细胞周期中G1/G0期比例，促进癌细胞快速跨越G0期，进而促进癌细胞的增殖异常[13-14]。乳腺癌耐药蛋白BCRP的表达异常，可以促进癌细胞膜内的抗癌药物的排出，导致抗癌药物生物活性的下降，进而促进癌细胞对于药物的耐受。同时，BCRP可以增强细胞膜上ATP依赖性的转运蛋白的活性，进而促进细胞膜内抗癌药物经过转运蛋白的外排，提高其耐药能力。已有的研究探讨了BCRP及ALDH1在乳腺癌组织中的异常表达[15-17]，但缺乏对于二者与乳腺癌临床病理特征间的关系研究。

本研究发现，乳腺癌组织中的BCRP及ALDH1的阳性表达率均可达50%以上，阳性表达率较高，明显高于癌旁正常对照，差异均有统计学意义（P < 0.01），提示BCRP及ALDH1可能参与到乳腺癌的发生发展过程中。BCRP及ALDH1的异常表达，可以通过影响到癌细胞侵袭能力、对于临近正常组织的浸润及远处器官的转移等，进而促进乳腺癌患者病情的进展。王瑾等[18-19]研究者通过回顾性分析研究了82例样本量的临床资料，发现乳腺导管细胞癌组织中的BCRP及ALDH1表达阳性率可较正常对照组织上升25%以上，且患者的病情越为严重、临床预后越差，BCRP及ALDH1的表达阳性率越高，这与本研究的结论较为一致。在具有腋窝淋巴结转移的患者中，BCRP及ALDH1的表达阳性率较高，高于阴性表达组，差异具有统计学意义，从生物学机制上考虑，BCRP及ALDH1的异常表达与乳腺癌关系主要可能与以下原因有关：①BCRP及ALDH1的高表达，在促进细胞线粒体氧化应激损伤、促进癌细胞细胞周期调控异常的同时，可以促进其对于淋巴结内皮细胞的浸润，促进癌细胞通过淋巴管进行转移；②BCRP及ALDH1的异常表达，可以通过新生的微淋巴结及淋巴液引流等途径，进而导致腋窝淋巴结的阳性表现。同时，本研究发现ER阳性患者BCRP蛋白表达阳性率为87.50%，提示BCRP的表达与雌激素受体信号通路的异常激活可能存在一定的相关性，BCRP的异常表达可以加剧ER激活导致的细胞内第二信使的上调，提高三磷酸腺苷或者钙离子的浓度，进而导致信号传导异常或者癌细胞异常增殖的发生[20]。但本研究并未发现组织分级、TNM分期和PR与相关生物学指标的关系，同时BCRP及ALDH1二者并不相关。

综上所述，ALDH1和BCRP在乳腺癌发生发展中有一定作用，可能参与了肿瘤的侵袭、转移等。但本研究对于ALDH1和BCRP与乳腺癌患者的5年生存率或者中位生存时间等的关系研究不足，存在一定的局限性。

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（收稿日期：2018-01-03 本文编辑：任 念）