高糖状态对前列腺癌细胞氧化应激状态的影响

张志涛 张红艳 牛芳芳

[摘要] 目的 探討高糖状态对前列腺癌细胞氧化应激状态的影响。 方法 人前列腺癌细胞株LNCap经过不同葡萄糖浓度处理后，采用DCFH-DA荧光探针检测LNCap细胞活性氧（ROS）水平，采用过氧化氢（H2O2）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）试剂盒检测LNCap细胞中H2O2水平以及各抗氧化酶活性；采用Western blot检测LNCap细胞中SOD1和SOD2蛋白表达水平；LNCap细胞转染si-SOD2后检测H2O2水平。 结果 LNCap细胞内ROS和H2O2水平随葡萄糖浓度升高而升高，且呈浓度依赖性（P < 0.05）；LNCap细胞内T-SOD、CAT活性在高糖环境中明显增强（P < 0.05），而GPX活性无明显变化（P > 0.05）；在高糖环境中，LNCap细胞内SOD2表达水平明显升高（P < 0.05），而SOD1表达水平无明显变化（P > 0.05）；SOD2基因沉默后，高糖环境下LNCap细胞内H2O2水平明显降低（P < 0.05）。 结论 高糖状态对前列腺癌细胞氧化应激水平具有促进作用，H2O2水平的升高可能受SOD2表达的调控。

[关键词] 高糖；前列腺癌细胞；活性氧；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶

[中图分类号] R737.250.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（b）-0017-04

Effects of high glucose state on oxidative stress in prostate cancer cells

ZHANG Zhitao1 ZHANG Hongyan2 NIU Fangfang1

1.The Second Department of Uropoiesis Surgical， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056001， China； 2.Department of Inspection， Medical College of Hebei Engineering University ， Hebei Province， Handan 056001， China

[Abstract] Objective To explore the effects of high glucose state on oxidative stress in prostate cancer cells. Methods Human prostate cancer cell line LNCap was treated with different glucose concentrations， and the level of LNCap cells reactive oxygen species （ROS） was detected by DCFH-DA fluorescent probe. The hydrogen peroxide （H2O2）， total superoxide dismutase （T-SOD）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GPX） kits were used to detect H2O2 level and antioxidant enzymes activities in LNCap cells. Western blot was used to detect the expression levels of SOD1 and SOD2 protein in LNCap cells. The level of H2O2 was detected after LNCap cells transfected with si-SOD2. Results The levels of ROS and H2O2 in LNCap cells were increased with the increase of glucose concentration， and were concentration-dependent （P < 0.05）. The activities of T-SOD and CAT in LNCap cells were increased significantly in the high glucose environment （P < 0.05）， but there was no significant change in the activity of GPX （P > 0.05）. In the high glucose environment， the expression level of SOD2 in LNCap cells was increased significantly （P < 0.05）， but the expression level of SOD1 was not significantly changed （P > 0.05）. After the SOD2 gene was silenced， the level of H2O2 in the LNCap cells was decreased significantly in the high glucose environment （P < 0.05）. Conclusion High glucose state can promote the oxidative stress level of prostate cancer cells， and the increase of H2O2 level may be regulated by the expression of SOD2.

[Key words] High glucose； Prostate cancer cells； Reactive oxygen species； Catalase； Superoxide dismutase

前列腺癌是常见于中老年男性的恶性肿瘤，发病率随年龄增长而升高，死亡率在男性恶性肿瘤中位居第二，仅次于肺癌[1]。糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，一般由胰岛素功能障碍或分泌减少引起[2]。许多研究认为2型糖尿病与多种实体恶性肿瘤发生发展有关，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、大肠癌等[3-8]。有研究显示，氧化应激可促进前列腺癌的发生[9-10]。所以本研究从细胞水平上观察高糖对前列腺癌细胞氧化应激的影响，以揭示糖尿病对前列腺癌发病影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人前列腺癌细胞株LNCap（BNCC337702）购自于ATCC；无糖型RPMI1640 培养基（SH30809.01B）、胰酶（SH30042.02）、胎牛血清（SH30370.03）购自美国Hyclone公司；葡萄糖（G8270-100G）购自美国Sigma公司；活性氧（ROS）（S0033）、过氧化氢（H2O2）（S0038）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）（S0101）、过氧化氢酶（CAT）（S0051）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）（S0056）检测试剂盒以及Western blot显色剂（P0203）购自江苏碧云生物技术研究所；小干扰RNA（si-SOD2）由上海吉玛制药技术有限公司合成；SOD1单抗（FL-154）和SOD2单抗（G-20）购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组 取LNCa细胞分别在含有5.5、12.5、25 mmol/L葡萄糖的培养基中培养，作为实验对象，分别为5.5 mmol/L Glu组、12.5 mmol/L Glu组、25 mmol/L Glu组，另取LNCa细胞在含有5.5 mmol/L葡萄糖和19.5 mmol/L 甘露醇（渗透压相同）的培养基中培养，作为对照，为5.5 mmol/L Glu+Mannitol组。各组培养48 h后，采用不同方法进行相应指标检测。转染si-SOD2后，更换25 mmol/L葡萄糖的培养基继续培养的LNCa细胞视为25 mmol/L Glu+si-SOD2组。

1.2.2 ROS含量检测 将生长状态良好的LNCap细胞消化，吹打均匀后离心重悬，调整细胞浓度至6×105/孔接种到6孔板中，分别进行不同干预处理后，在培养箱中静置培养。DCFH-DA采用无血清培养基稀释（1∶1000），使终浓度为10 μmol/L。去除培养基，每孔加入1 mL DCFH-DA，在37℃下孵育20 min，然后用无血清培养基洗涤2～3次，胰酶消化后重悬，采用流式细胞仪检测DCFH-DA荧光强度。

1.2.3 H2O2含量检测 将LNCap细胞消化后收集至离心管内，3000 r/min离心5 min（半径：8.52 cm）后弃上清，加入H2O2检测裂解液，在细胞充分裂解后，低温离心，收集上清，待检测。按照试剂盒说明书将标准溶液按比例依次稀释。选取96孔板。每孔加入样品或标准品各50 μL，然后加入H2O2检测试剂100 μL。采用酶标仪在波长为560 nm时测定吸光度，并根据绘制的标准曲线计算样品中H2O2含量。

1.2.4 T-SOD活性检测 收集LNCap细胞，加入细胞裂解液将细胞充分裂解，将待测样品分别加入对照溶液、WST工作液和酶工作液，混匀后在37℃下孵育20 min，采用酶标仪在波长为450 nm时测定吸光度，并计算SOD酶活力。

1.2.5 CAT活性检测 收集LNCap细胞，充分裂解细胞，调整蛋白终浓度至0.2 mg/mL。按照试剂盒说明书将标准溶液按比例依次稀释。取裂解液5 μL加入EP管，然后加入CAT检测缓冲液35 μL，充分混匀后再加入H2O2溶液10 μL，在室温下反应5 min，加入CAT反应终止液450 μL。另取EP管，加入CAT检测缓冲液40 μL和上述已终止的反应体系10 μL至96孔板中，最后加入H2O2显色液200 μL。室温下孵育20 min后，采用酶标仪在波长为520 nm时测定吸光度，并计算CAT活性。

1.2.6 GPX活性检测 收集LNCap细胞，加入细胞裂解液将细胞充分裂解，在96孔板中加入GPX缓冲液、待测样品以及GPX检测工作液混匀，然后加入过氧化物溶液，再次混匀，采用酶标仪在波长为340 nm时测定吸光度，并计算GPX活性。

1.2.7 Western blot检测 提取细胞总蛋白，测量待测蛋白样本浓度，并使之标准化。经加热变性、SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育，SOD1和SOD2和GAPDH单抗均按1︰1000稀释，二抗按1︰5000稀释。最后在暗室显影并拍照，采用Quantity One软件分析条带灰度值。

1.2.8 转染实验 待LNCap细胞密度长至75%～80%，根据Lipofectamine TM 2000说明步骤将SOD2沉默效果较好的si-SOD2转染至LNCap细胞，更换培养基时采用含25 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h，然后提取总蛋白进行Western blot检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖对前列腺癌细胞总ROS的影响

结果显示，12.5 mmol/L Glu組和25 mmol/L Glu组ROS水平明显高于5.5 mmol/L Glu组（P < 0.05），25 mmol/L Glu组ROS水平明显高于12.5 mmol/L Glu组（P < 0.05）；5.5 mmol/L Glu+Mannitol组与5.5 mmol/L Glu组ROS水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.2 高糖对前列腺癌细胞H2O2的影响

结果显示，12.5 mmol/L Glu组和25 mmol/L Glu组H2O2水平明显均高于5.5 mmol/L Glu组（P < 0.05），25 mmol/L Glu组H2O2水平明显高于12.5 mmol/L Glu组（P < 0.05）；5.5 mmol/L Glu+Mannitol组与5.5 mmol/L Glu组H2O2水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 高糖对前列腺癌细胞抗氧化酶活性的影响

结果显示，12.5 mmol/L Glu组和25 mmol/L Glu组总SOD活性和CAT活性均明显高于5.5 mmol/L Glu组（P < 0.05），25 mmol/L Glu组总SOD活性明显高于12.5 mmol/L Glu组（P < 0.05）；5.5 mmol/L Glu+Mannitol组与5.5 mmol/L Glu组总SOD活性和CAT活性差异无统计学意义（P > 0.05）。各组GPX活性差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.4 高糖对前列腺癌细胞SOD1和SOD2表达的影响

结果显示，12.5 mmol/L Glu组和25 mmol/L Glu组SOD2蛋白表达水平高于5.5 mmol/L Glu组（P < 0.05）；25 mmol/L Glu组SOD2蛋白表达水平高于12.5 mmol/L Glu组（P < 0.05）；但各组SOD1蛋白表达水平无明显变化（P > 0.05）。见图4。

2.5 SOD2对H2O2的调控作用

结果显示，25 mmol/L Glu+si-SOD2组H2O2水平较25 mmol/L Glu组明显下降（P < 0.05）。见图5。

3 讨论

许多流行病学研究发现糖尿病会影响前列腺癌的发生，与正常人群比较，糖尿病患者发生前列腺癌的风险较低[11]。随后，有报道通过调查美国糖尿病退伍军人癌症发病率，发现患有糖尿病的白种人和黑种人前列腺癌发病率明显降低[12]。而国内许多研究认为糖尿病与前列腺增生、前列腺癌等疾病发病呈正相关[13-14]。

有研究报道，良性前列腺增生与前列腺癌细胞中的氧化应激指标存在明显差异，前列腺癌细胞氧化应激反应明显较强[15]。氧化应激是机体氧化系统和抗氧化系统失衡，氧化系统加强，抗氧化系统减弱，导致蛋白酶分泌增加、炎性细胞浸润、氧化中间产物增多的状态[16]。氧化应激介导的脂质过氧化反应以及诱发的细胞增殖会对血管正常生理状态造成影响，引起细胞突变或增殖分化，加速前列腺细胞增殖和重塑，在前列腺癌发生过程中起到一定作用[17]。在正常生理状态下，ROS可作为第二信使参与细胞生理机能调控，但当ROS水平过高时，则会引起染色体变异、细胞凋亡以及肿瘤形成[18]。所以本研究着重于研究糖尿病与氧化应激的关系，在细胞水平上营造高糖环境，观察高糖对LNCap细胞氧化应激的影响。

ROS主要包括超氧阴离子、H2O2、羟自由基等，是氧气衍生的多种化学分子的统称。本研究结果显示，LNCap细胞内ROS水平随着葡萄糖浓度增加而增加，H2O2作为ROS中重要成分之一，也随着葡萄糖浓度增加而增加；抗氧化系统的总SOD、CAT活性随着葡萄糖浓度增加而增加，GPX无明显变化，且均与渗透压无关。以上结果提示，LNCap细胞在高糖环境下处于氧化应激状态，SOD和CAT等抗氧化酶水平的升高可能与细胞代偿反应有关。SOD是机体内最重要的抗氧化酶之一，是唯一可清除体内超氧阴离子的抗氧化酶，通过歧化反应将超氧阴离子转化为H2O2，产生的H2O2再在CAT和GPX等酶作用下分解为水和氧气等无害物质[19]。SOD1和SOD2是SOD的两个不同亚型，SOD1活性位点含有锌和铜，SOD2 活性位点含有锰[20]。为了探讨总SOD中受到高糖影响的是SOD1还是SOD2，本研究采用Western blot检测不同葡萄糖浓度下LNCap细胞表达SOD1和SOD2的水平，结果发现SOD1表达水平不受葡萄糖浓度影响，而SOD2表达水平随葡萄糖浓度升高而增强，提示高糖可增强LNCap细胞中SOD2的表达。将SOD2基因沉默后，H2O2水平也明显降低，说明H2O2水平升高可能与高糖环境下SOD2表达增强有关。

综上所述，高糖可明显升高前列腺癌细胞中ROS和H2O2水平，促进氧化应激反应，其中H2O2水平受SOD2抗氧化酶调控，H2O2能否對肿瘤发生发展产生影响还需进一步研究。本研究初步揭示了糖尿病患者体内的氧化应激状态可能是影响前列腺发病的原因之一，为糖尿病合并前列腺癌患者的治疗提供了新方向。

[参考文献]

[1] 叶定伟，朱耀.中国前列腺癌的流行病学概述和启示[J].中华外科杂志，2015，53（4）：249-252.

[2] 曾胜，岳亮，申慧青，等.糖尿病对前列腺癌的影响[J].现代泌尿外科杂志，2016，21（7）：558-561.

[3] 郑岚，钟春生，郑浩，等.2型糖尿病与恶性肿瘤关系的临床回顾性研究[J].安徽中医药大学学报，2015，34（3）：40-41.

[4] 王许，李庆龙，刘颖.2型糖尿病与肺癌发生的相关性分析[J].癌症进展，2016，14（7）：693-695.

[5] 高梅娟，张丽杰，于春梅.抗糖尿病药物与乳腺癌相关性研究[J].中国预防医学杂志，2016，17（6）：442-446.

[6] 姜新，吕然然，谢晓娜，等.糖尿病与胰腺癌关系的研究进展[J].中国实验诊断学，2016，20（2）：338-339.

[7] 王欢，赵晓梅，杨倩.糖尿病与膀胱癌关系的病例对照研究[J].哈尔滨医科大学学报，2015，49（4）：335-337.

[8] 许召杰，周学良，豆萌萌，等.降糖药物与2型糖尿病患者大肠癌发病风险及疗效的Meta分析[J].中华普通外科杂志，2016，31（7）：596-600.

[9] 姚志灵，陈亮，王欣丽.不同糖代谢状态冠心病患者氧化应激的研究进展[J].中国医药导报，2015，12（26）：46-49.

[10] Geybels MS，Pa VDB，van Schooten FJ，et al. Oxidative stress-related genetic variants，pro-and antioxidant intake and status，and advanced prostate cancer risk [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2015，24（1）：178-186.

[11] Giovannucci E，Harlan DM，Archer MC，et al. Diabetes and cancer：a consensus report [J]. CA Cancer J Clin，2010， 60（4）：207-221.

[12] Atchison EA，Gridley G，Carreon JD，et al. Risk of cancer in a large cohort of U.S. veterans with diabetes [J]. Int J Cancer，2011，128（3）：635643.

[13] Wang M，Hu RY，Wu HB，et al. Cancer risk among patients with type 2 diabetes mellitus：a population-based prospective study in China [J]. Sci Rep，2015，2016，5：11 503.

[14] Long XJ，Lin S，Sun YN，et al. Diabetes mellitus and pro？鄄state cancer risk in Asian countries：a meta-analysis [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（8）：4097-4100.

[15] 张志涛，张红艳.氧化应激在良性前列腺增生和前列腺癌发病中的作用研究[J].现代预防医学，2013，40（9）：1781-1782.

[16] 梁馨予，张婷，周永，等.杨梅素减轻高糖诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤[J].第三军医大学学报，2013，35（21）：2301-2305.

[17] Jin Y，Wang L，Qu S，et al. STAMP2 increases oxidative stress and is critical for prostate cancer [J]. EMBO Mol Med，2015，7（3）：315-331.

[18] Li W，Ma Q，Liu J，et al. Hyperglycemia as a mechanism of pancreatic cancer metastasis [J]. Front Biosci，2012， 17（1）：1761-1774.

[19] 黎韡，徐勤鴻，马清涌.高糖状态对胰腺癌细胞氧化应激水平的促进作用[J].西安交通大学学报：医学版，2016， 37（6）：789-794.

[20] 王悦，徐开红，徐萍.氧化应激反应因子CAT、GPX1、SOD1、SOD2、TXNL1和LOX-1与反复自然流产的相关性[J].中国卫生检验杂志，2014，24（17）：2515-2517.

（收稿日期：2018-01-31 本文编辑：任 念）