β淀粉样蛋白1⁃42对滋养细胞迁移和侵袭的影响

廖丹丹 蔡丹纯 高云飞 盛超

南方医科大学南方医院妇产科（广州 510515）

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种以高血压和蛋白尿为主要临床表现、严重危害母儿健康的妊娠期特发性疾病。在我国发病率为2%～8%，是围生期母婴死亡的主要原因之一［1］。目前主流观点普遍认为子宫螺旋动脉重铸障碍导致胎盘形成缺陷是PE发病的始动因素［2-3］，而螺旋动脉血管重铸障碍的实质是滋养细胞侵袭能力下降［4］。最近蛋白质组学研究发现，包括β淀粉样蛋白（Aβ 1⁃42）在内的多种错误折叠蛋白异常聚集于PE患者的胎盘绒毛滋养细胞及绒毛间质，提示PE可能是一类蛋白质构象疾病［5］。然而，目前国内外未见β淀粉样蛋白1⁃42对滋养细胞迁移和侵袭功能影响的报道。本研究拟利用体外细胞模型，深入探讨Aβ1⁃42对滋养细胞迁移、侵袭的影响及调控机制，为β淀粉样蛋白在PE的病理发生中所起的作用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料本研究所用的细胞系为永生化的人早孕滋养细胞系HTR⁃8/SVneo细胞，由加拿大皇后大学Charles H.Graham教授惠赠。主要试剂：Aβ 1⁃42购自Sigma公司；培养基RPMI 1640和胎牛血清购自GIBCO公司；CCK⁃8检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；总蛋白提取试剂盒购自普利莱基因技术有限公司；vimentin，N⁃cad⁃herin抗体购自Cell Signaling Technology；β⁃actin抗体购自武汉博士德公司；辣根过氧化物酶IgG购自北京中杉金桥公司；抗 Aβ1⁃42抗体、MMP⁃2及MMP⁃9 ELISA试剂盒购自Abcam；MMP⁃2/MMP⁃9活性检测试剂盒购自AnaSpec。

1.2 实验方法

1.2.1 Aβ1⁃42的配制将Aβ1⁃42冻干粉溶于DMEM培养基，配制成200μmol/L储备液，置于37℃培养箱孵育7 d，使之老化，过滤分装，-20℃保存。临用时以DMEM培养基稀释到所需浓度。

1.2.2 细胞的培养及分组HTR⁃8/SVneo细胞系培养于含10%胎牛血清的1640培养基，适时换液及传代。细胞处理具体分组为：（1）对照组：在正常条件下培养HTR⁃8/SVneo 细胞；（2）Aβ1⁃42组：加入10 μmol/L Aβ1⁃42处理HTR⁃8/SVneo细胞24 h；（3）Aβ1⁃42＋抗Aβ1⁃42抗体组：同时加入10 μmol/L Aβ1⁃42及1：750稀释抗Aβ1⁃42抗体处理HTR⁃8/SVneo细胞24 h。

1.2.3 CCK⁃8法测定细胞活力取对数生长期的HTR⁃8/SVneo细胞，接种于96孔板，每孔1× 104个细胞，培养过夜，之后给予不同浓度 Aβ1⁃42（0、5、10、15、20 μmol/L），同时设立对照组，每组设置5个复孔，并设立空白组。处理24 h后，每孔加入CCK⁃8试剂10μL，继续培养2 h。酶标仪测定各个孔在450 nm波长处的吸光度（OD）值。细胞增殖活性（%）=（实验组细胞OD值⁃空白组OD值）/（对照组细胞OD值-空白组OD值）×100%。

1.2.4 Transwell小室检测细胞迁移能力选取24孔板的Transwell小室，每组各设3个复孔。上述各组细胞经终止消化后离心弃去培养液，PBS洗涤2遍，用无血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数并调整细胞密度为5×105/mL，各组分别取200μL加入到上室内，取600μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基加入到下室，37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后取出24孔板，用干燥起来的棉签擦拭上室底部表面未穿过膜的细胞，PBS洗涤2遍后甲醛固定30 min，结晶紫染色5 min，显微镜下拍照，随机取6个不同的视野（×200）观察并记录穿膜的细胞数，实验重复3次，计算每组小室细胞的平均数。

1.2.5 Transwell小室检测细胞侵袭能力4℃融化Matrigel，于冰上将Matrigel用磷酸盐缓冲液（phosphate⁃buffered saline，PBS）按照1∶8稀释。把Transwell小室放入24孔板中，取50μL稀释好的Matrigel铺在小室内，放入细胞培养箱中2～3 h促胶凝固。Transwell上室中分别加入4个组的细胞悬液（密度为1×105个/mL）200μL，下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2培养箱继续培养24 h，清洗膜，甲醛固定30 min，结晶紫染色5 min，显微镜下拍照，随机取6个不同的视野（×200）观察并记录穿膜的细胞数，实验重复3次，计算每组小室细胞的平均数。

1.2.6 Western blot检测vimentin，N⁃cadherin蛋白的表达水平取对数生长期细胞计数后按1∶3比例接种于60 mm细胞培养皿内，培养箱中预培养24 h后，按上述分组法放置培养箱中孵育24 h。取各组HTR⁃8/SVneo细胞，根据总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，用全自动生化分析仪（Beckman）测定蛋白质浓度。根据蛋白浓度取适量进行SDS⁃PAGE分离蛋白。将蛋白转移到硝酸纤维素膜后，将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中摇床上封闭2 h，用TBST洗膜10 min，共3次，分别用vimentin、N⁃cadherin和β⁃actin的Ⅰ抗按适当比例4℃孵育过夜，再洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG孵育2 h，最后洗膜3×10 min，化学发光。实验重复3次。

1.2.7 ELISA法检测MMP⁃2及 MMP⁃9表达水平收集细胞培养上清液，按试剂盒说明书进行操作，检测对照组、10μmol/L Aβ1⁃42组及10μmol/L Aβ1⁃42＋1∶750稀释抗Aβ1⁃42抗体组细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9水平。实验重复3次。

1.2.8 MMP⁃2/MMP⁃9活性检测试剂盒检测MMP⁃2及MMP⁃9活性水平收集细胞培养上清液，按试剂盒说明书进行操作，检测对照组、10μmol/L Aβ1⁃42组及10 μmol/L Aβ1⁃42＋1∶750稀释抗Aβ 1⁃42抗体组细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9活性水平。实验重复3次。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。计量资料均用Kolmogorov⁃Smirnov检验方法检验符合正态性分布，采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。两独立样本t检验方法检验其方差齐性，采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ1⁃42体外刺激对滋养细胞活力的影响采用CCK⁃8法进行细胞活力检测，如图1所示，不同浓度Aβ1⁃42处理后对HTR⁃8/SVneo细胞活力产生不同影响。与对照组相比，10μmol/L Aβ1⁃42处理组细胞活力显著降低（P＜0.05），15μmol/L及20μmol/L处理组细胞活力与10μmol/L Aβ1⁃42处理组无明显差异，5μmol/L Aβ1⁃42处理组对细胞活力无明显影响。

2.2 Aβ1⁃42体外刺激对滋养细胞迁移的影响Transwell迁移试验结果显示，Aβ1⁃42组HTR⁃8/SVneo细胞迁移能力较对照组显著下降（P＜0.05）；Aβ1⁃42＋抗Aβ1⁃42抗体组细胞迁移能力高于Aβ 1⁃42组，与对照组接近（P＞ 0.05，图2）。

2.3 Aβ1⁃42体外刺激对滋养细胞N⁃cadherin、vi⁃mentin蛋白表达的影响N⁃cadherin及vimentin是反映细胞迁移状态的重要指标。Aβ1⁃42处理HTR⁃8/SVneo细胞后，N⁃cadherin、vimentin蛋白表达水平较对照组明显下降；然而，同时加入抗Aβ1⁃42抗体共同处理细胞后，N⁃cadherin及vimentin蛋白表达水平显著上升（图3）。

图1 Aβ1⁃42抑制HTR⁃8/SVneo细胞活力Fig.1 Amyloid β⁃peptide（1⁃42）inhibited HTR⁃8/SVneo cells viability

图2 Aβ1⁃42抑制HTR⁃8/SVneo细胞迁移Fig.2 Amyloid β⁃peptide（1⁃42）inhibited HTR⁃8/SVneo cells migration ability

图3 Aβ1⁃42下调HTR⁃8/SVneo细胞中N⁃cadherin、vimentin蛋白的表达Fig.3 Amyloid β⁃peptide（1⁃42）inhibited protein levels of N⁃cadherin and vimentin in HTR⁃8/SVneo cells

2.4 Aβ1⁃42体外刺激对滋养细胞侵袭的影响Transwell侵袭试验结果显示，Aβ1⁃42组HTR⁃8/SV⁃neo细胞侵袭能力较对照组显著下降（P＜0.05）；Aβ1⁃42＋抗Aβ1⁃42抗体组细胞侵袭能力高于Aβ 1⁃42组，与对照组接近（P＞ 0.05，图4）。

图4 Aβ1⁃42抑制HTR⁃8/SVneo细胞侵袭Fig.4 Amyloid β⁃peptide（1⁃42）inhibited HTR⁃8/SVneo cells invasion ability

2.5 Aβ1⁃42体外刺激对滋养细胞 MMP⁃2及MMP⁃9表达的影响ELISA法检测细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9表达水平，发现Aβ1⁃42处理细胞后，细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9的表达水平较对照组明显下降（P＜0.05）；然而，同时加入抗Aβ1⁃42抗体共同处理细胞后，细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9表达水平明显上升，与对照组接近（P＞0.05，图5）。

2.6 Aβ1⁃42体外刺激对滋养细胞 MMP⁃2及MMP⁃9活性的影响MMP⁃2/MMP⁃9活性检测试剂盒检测MMP⁃2及MMP⁃9活性水平，发现Aβ1⁃42处理细胞后，细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9活性较对照组明显下降（P＜0.05）；然而，同时加入抗Aβ1⁃42抗体共同处理细胞后，细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9活性明显上升，与对照组接近（P＞ 0.05，图6）。

图5 Aβ1⁃42抑制HTR⁃8/SVneo细胞MMP⁃2及MMP⁃9表达Fig.5 Amyloid β⁃peptide（1⁃42）inhibited MMP⁃2 and MMP⁃9 expression in HTR⁃8/SVneo cells

图6 Aβ1⁃42抑制HTR⁃8/SVneo细胞MMP⁃2及MMP⁃9活性Fig.6 Amyloid β⁃peptide（1⁃42）decreased MMP⁃2 and MMP⁃9 activity in HTR⁃8/SVneo cells

3 讨论

蛋白质的正确折叠是确保其形成特定构象的关键因素，由于蛋白质错误折叠发生构象改变，并在机体内异常蓄积而引发的组织病变称为蛋白质构象病［6］。迄今已发现有20多种蛋白能发生异常聚集，形成淀粉样沉淀，导致神经退行性疾病等“构象病”的发生［7］。最近研究表明，蛋白错误折叠与PE的关系十分密切。BUHIMSCHI、KALKUNTE等研究人员对PE患者的血清、尿液进行蛋白质组学分析，发现PE患者的血清及尿液中均有多种构象错误蛋白的沉积，如：Aβ、SERPINA1、albumin、interferon⁃inducible protein 6⁃16 等［8-9］。而且，PE 患者的胎盘中APP及相关分泌酶均过量表达，导致大量寡聚化的Aβ生成并聚集沉淀于胎盘绒毛滋养细胞及绒毛间质，其中以42个氨基酸Aβ寡聚体（Aβ1⁃42）为主要形式［5］。

Aβ是由淀粉样前体蛋白（amyloidβ⁃protein precursor，APP）经β⁃和γ⁃分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽，大多与伴侣蛋白分子结合。Aβ具有寡聚化的特性，容易发生构象错误，在引起氧化应激和神经退行性病变中发挥直接、重要的作用［10］，但Aβ在PE发病中的具体作用和分子机制目前尚不明确。既往研究表明，PE患者子宫螺旋动脉血管内滋养细胞的数量极少，导致滋养细胞对子宫螺旋动脉的重铸极其不足，引起管腔狭窄，胎盘发育不完善［2-3］，因此滋养细胞生理迁移、侵袭能力下降可能是PE发病的重要因素［4］。因此本研究利用Aβ1⁃42 体外刺激HTR⁃8/SVneo细胞，深入探讨Aβ1⁃42对滋养细胞迁移、侵袭的影响及其调控机制。

本研究发现，Aβ1⁃42处理HTR⁃8/SVneo细胞后，细胞迁移能力较对照组显著降低，Western blot结果发现N⁃cadherin、vimentin蛋白表达水平较对照组明显下降。N⁃cadherin是钙黏附素家族的主要成员，参与介导细胞与细胞间的动态黏附。有研究证实，N⁃cadherin及其调控转录因子Twist在绒毛膜外细胞滋养细胞（extravillous cytotropho⁃blasts，EVT）中高表达，进而促进EVT迁移。通过利用siRNA靶向沉默Twist基因以降低N⁃cadherin表达时，发现滋养细胞迁移能力明显下降，提示N⁃cadherin的高表达与滋养细胞的生理浸润和迁移关系密切［11-13］。vimentin是维持细胞骨架结构的重要蛋白，有研究证实，上皮来源肿瘤中出现vimentin的高表达与肿瘤侵袭和转移呈正相关［14］。DU等［15］对PE孕妇胎盘组织进行研究发现，PE孕妇胎盘组织中vimentin的mRNA及蛋白表达水平均较正常孕妇胎盘下降，提示vimentin可能在滋养细胞的生理性浸润中起着重要作用。本研究通过Transwell侵袭实验发现Aβ1⁃42处理HTR⁃8/SVneo细胞后，细胞侵袭能力较对照组显著下降，ELISA法检测细胞培养上清液中MMP⁃2及MMP⁃9表达水平、MMP⁃2/MMP⁃9活性检测试剂盒检测MMP⁃2及MMP⁃9活性，发现Aβ1⁃42组MMP⁃2及MMP⁃9表达水平及活性均较对照组明显下降。MMP⁃2、MMP⁃9是MMPs家族中重要的成员，研究表明，MMP⁃2、MMP⁃9与滋养细胞的侵袭力、重铸螺旋动脉及胎盘形成过程密切相关［16-18］。MMP⁃2、MMP⁃9被激活后可以形成Ⅳ型胶原酶降解细胞外基质中Ⅳ型胶原和明胶，为滋养细胞的侵入创造条件［19］。本实验结果提示Aβ1⁃42抑制滋养细胞的侵袭能力，可能导致螺旋动脉血管重铸障碍。

综上所述，Aβ1⁃42抑制滋养细胞的迁移、侵袭能力，可能导致螺旋动脉血管重铸障碍，为β淀粉样蛋白在PE的病理发生中所起的作用提供理论和实验依据。然而，Aβ1⁃42对于滋养细胞迁移、侵袭能力影响的确切分子机制仍有待进一步研究。