过表达IL-8受体对脐带源间充质干细胞生物活性的影响

王飒，王文强，李秋实，慕晓玲*

（石河子大学医学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002）

人脐带源间充质干细胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)由于其易获取和免疫原性低备受研究者的关注，其在器官组织损伤后的修复和再生方面具有良好的临床应用前景[1]。然而如何保证移植入体内的hUC-MSCs向受损组织定向迁移仍是其在临床广泛应用的限制因素。因此对招募MSCs迁移归巢到组织损伤部位的调控机制研究是促进其临床成功应用的重要一步。当前认为MSCs从循环系统中向缺血缺氧性损伤、炎性反应、机械损伤、烧伤等组织的迁移主要是损伤部位分泌的趋化因子的招募作用，趋化因子是在炎症中激活的小分子蛋白，控制着细胞的招募[2]。白介素-8(interleukin-8，IL-8/CXCL8)是一种细胞因子，属于CXC趋化因子家族。在炎性因子刺激下，多种细胞，包括内皮细胞能够分泌IL-8。IL-8对中性粒细胞?嗜碱性粒细胞和T细胞具有强大的趋化作用，与多种炎症的发生有关。而中性粒细胞是机体反应较早的防御?对抗组织损伤的白细胞，在损伤或感染组织释放的趋化因子IL-8的诱导下，中性粒细胞迁移到损伤组织，IL-8能选择性地与中性粒细胞膜表面的IL-8RA和IL-8RB结合，激活的IL-8受体通过诱导趋化因子调节子表达，触发局部炎症反应[3-4]。

Ringe J等[5-6]第一次证实，表达IL-8受体的骨髓间充质干细胞向损伤部位募集是由于炎症反应中产生的趋化因子，如 IL-8、IL-12、CCL 等[5-6]趋化所致。另外已有研究表明，静脉输注过表达IL-8受体(Interleukin-8 RA and/or RB receptors)的内皮细胞治疗实验动物颈动脉内皮损伤的效果引人注目。加载IL-8受体的内皮细胞模拟了中性粒细胞的行为，与中性粒细胞竞争性地和过表达IL-8受体的损伤内皮细胞结合，从而抑制了中性粒细胞引发的炎症反应，促进了内皮的再生和血管修复[7]。然而IL-8RA/B过表达对MSCs的动员、迁移和募集等的影响研究还很少。

本研究以hUC-MSCs为研究对象，通过重组腺病毒转染提高hUC-MSCs细胞膜上IL-8的特异性受体IL-8RA/B的表达，观察其对MSCs细胞趋化、增殖、粘附能力的影响，以寻找进一步提高hUCMSCs归巢能力的条件，从而提高hUC-MSCs移植的临床治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

脐带取自石河子大学第一附属医院妇产科健康的剖宫产产妇，均经产妇知情同意。pAd-IL-8RAGFP、pAd-IL-8RB-GFP和 pAd-Null-GFP腺病毒由美国阿拉巴马大学医学院医学系教授赠送；胎牛血清、DMEM /Low Glucose(Gibco公司)；胰蛋白酶(Solarbio)；IL-8 细胞因子 (Peprotech 公司)；cck-8 试剂盒(日本同仁)。

1.2 方法

1.2.1 人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离、培养

将无菌条件下取得的脐带放入含有青霉素和链霉素的无菌平衡磷酸盐溶液(PBS)中，4 h内在细胞培养实验室超净台中按照文献[8]所述的人脐带间充质干细胞分离、培养的方法，用PBS缓冲液反复冲洗，洗去脐带上残留的血迹，将脐带剪成2-3 cm的小段，每段均沿着静脉腔剪开后剔除静脉，再剔除2根动脉，取出华通氏胶部分，用剪刀反复剪成约1-2 mm3小块，均匀接种于100 mm培养皿中，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于含5%CO2，37℃的培养箱内培养。4～5 d首次换液，以后每4天换液1次，待细胞长至80%～90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞(hUVECs)的分离、培养

取10 cm长的脐带，用PBS缓冲液反复冲洗，洗去脐带外侧及静脉腔内的血迹，静脉腔内加入5 mL 1%的Ⅱ型胶原酶，止血钳夹闭两端，用镊子轻轻揉搓脐带，10 min后用含10%FBS的培养基终止消化并冲脐静脉，收集细胞悬液，离心后用ECM 培养基重悬，加入培养皿中，置于含5%CO2，37℃的培养箱内培养。24 h后换液，待细胞长至80%～90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞表面标志物

取扩增传代至第3代的脐带源间充质干细胞，弃培养基，PBS缓冲液轻洗3遍，用0.25%胰蛋白酶消化，血清终止消化后用PBS缓冲液洗涤重悬，调整为细胞浓度为 1×106/mL的单细胞悬液，取0.5 mL/管，共5管，分别加入鼠抗人单克隆抗体FITC-CD29、FITC-CD44、FITC-CD34、FITC-HLA-DR各20 mL，充分混匀，避光，4℃冰箱孵育30 min，每管加入2 mLPBS缓冲液，流式细胞仪上机检测。

1.2.4 重组腺病毒转染hUC-MSCs

将 P3代hUC-MSCs细胞按50%～60%接种于DMEM 培养基(含10%FBS)中，将重组腺病毒pAd-IL-8RA-GFP/pAd-IL-8RB-GFP和 pAd-Null-GFP按照MOI=10，30，100，300 感染 hUC-MSCs，48 h 后用荧光显微镜观察 GFP表达情况以检测感染率。

1.2.5 CCK-8试剂盒检测腺病毒转染对hUC-MSCs增殖能力的影响

hUC-MSCs在腺病毒感染48 h后，消化离心重悬，将细胞按照4×103/孔接种于96孔板中，只加培养基为空白对照组，每组设四个复孔，细胞贴壁后0、24、36、48、72 h 分别加入 10 μL 的 CCK-8 试剂，2 h后用全波长多功能酶标仪于 460 nm 波长处测量每孔的OD值，以细胞培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制增殖曲线。

1.2.6 Transwell实验检测IL-8RA/B对hUC-MSCs迁移能力的影响

按上述分组对各组 hUC-MSCs细胞感染病毒48 h后，调整细胞为 106个 /mL，接种至 Transwell小室中 (孔径为 8 μm)，每上室加入100 μL细胞悬液，下室中加入600 μL含有100 ng/ml IL-8细胞因子的培养基，于 37℃培养箱中孵育24 h；取出Transwell小室后用棉签擦拭膜上层细胞，PBS洗3遍后4%多聚甲醛固定15 min；1%的结晶紫染色20 min，PBS洗3遍，100倍镜下观察，随机计数5个视野，计算染色细胞总数。

1.2.7 粘附实验检测IL-8RA/B过表达对hUC-MSCs向体外损伤内皮粘附能力的影响

取P3代hUVECs种于24孔板中，待60%～70%密度时，加入10 ng/mL的TNF-α，培养箱中孵育16 h，分别加入感染48 h的hUC-MSCs细胞悬液100 μL，培养箱孵育30 min后，PBS缓冲液洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，倒置荧光显微镜下观察，随机选取3个视野，计数粘附细胞数目[9]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 hUC-MSCs和hUVECs的分离、传代及鉴定

原代培养hUC-MSCs 5～7 d，倒置显微镜下可观察到成纤维样细胞从脐带组织块边缘爬出，一般14～16 d细胞可达到80%～90%融合，连续传代至P12代未见到细胞形态有明显改变（图1）。

图1 hUC-MSCs的分离、传代(100×)Fig.1 separation and passage of hUC-MSCs(100×)

经流式细胞仪检测，P3代hUC-MSCs细胞表达干细胞相关蛋白CD29、CD44，但不表达造血干细胞抗原CD34和白细胞相关抗原HLA-DR(图2)。

图2 流式细胞仪鉴定hUC-MSCsFig.2 Identification of hUC-MSCs by flow cytometry

原代培养hUVECs 4-5 d，细胞达到80%融合，镜下可见细胞成短梭形排列。vWF是内皮细胞特异性蛋白，免疫荧光显示hUVECs表达vWF几乎100%，结果如图3所示。

图3 vWF在hUVECs的表达Fig.3 expression of vWF in hUVECs

2.2 检测重组腺病毒转染hUC-MSCs的转染效率

按照不同感染复数体外转染hUC-MSCs 48 h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达，检测转染效率，结果发现MOI=100时，GFP的表达达到80%以上，并且细胞的状态良好，因此后续实验选择此MOI值进行转染（图4）。

图4 重组腺病毒转染hUC-MSCs后GFP的表达(100×)Fig.4 expression of GFP on hUC-MSCafter transfection(100×)

2.3 过表达IL-8RA/B对hUC-MSCs增殖能力的影响

CCK-8增殖实验测得转染和未转染hUC-MSCs在 24、36、48、72 h的 OD 值，并作出增殖曲线，统计学分析显示，与未转染的hUC-MSCs相比，过表达IL-8RA/B的hUC-MSCs的增殖能力并没有明显差异，P＞0.05（图 5）。

图5 腺病毒转染对hUC-MSCs增殖能力的影响Fig.5 Effect of adenovirus transfection on proliferation of hUC-MSCs

2.4 IL-8RA/B过表达 对hUC-MSCs迁移能力的影响

在IL-8的趋化作用下，观察到IL-8RA/B过表达组穿过小室的细胞数目明显多于未转染组和转染了空质粒组，两P值均＜0.01，而未转染组和空质粒组并无明显区别（图6）。

2.5 IL-8RA/B过表达对hUC-MSCs向损伤内皮粘附能力的影响(体外实验)

由于TNF-α 对内皮细胞造成损伤，导致内皮细胞释放IL-8因子，粘附实验的结果显示IL-8RA/B过表达组在损伤内皮上粘附的细胞数目明显多于空质粒组，P＜0.01（图 7）。

图6 IL-8RA/B过表达对hUC-MSCs迁移能力的影响Fig.6 Effect of IL-8RA/B on hUC-MSCs cell migration

图7 IL-8RA/B过表达对hUC-MSCs向损伤内皮粘附能力的影响Fig.7 Effect of IL-8RA/B overexpression on adhesion ability to injured endothelial monolayers of hUC-MSCs

3 讨论

血管内皮是一个多功能的器官，它在维持血管稳态、调节细胞增殖以及血管生成、防止血栓的形成、介导炎症与免疫反应等方面有着非常重要的作用。血管内皮损伤在冠心病、高血压、糖尿病等多种疾病的发生、发展中具有重要的病理意义[9]。减轻内皮损伤、促进内皮的修复对于抑制内膜增生有着关键的作用。MSCs是一类低免疫原性能够在体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等的多能干细胞，可从骨髓、脐带窦血、脐带胶样组织、胎盘、脂肪组织及肺组织等组织中分离，其作为组织工程修复的种子细胞受到越来越多的关注[10]。有研究表明，循环中以及周围组织中的MSCs在各种趋化因子及粘附分子的作用下，可以向损伤部位迁移发挥其修复作用，但是在机体受损的情况下，MSCs很难被动员起来[11-12]。Kim等研究者借助生物材料将MSCs覆盖在兔子模型颈动脉球囊损伤的血管部位，发现MSCs能够减轻损伤血管的内膜增生情况[13]。因此，移植的MSCs如何能够有效到达损伤部位仍是制约其细胞治疗效果的关键。

Rombouts等[14]发现经过传代培养的MSCs的归巢能力明显低于原代细胞，这可能是由于经过传代培养后MSCs表面某些受体的表达减少。近年来，关于SDF-1/CXCR4在MSCs中作用的研究非常多，CXCR4能够促进MSCs在体外向SDF-1迁移[15]，已经证明CXCR4过表达的MSCs能够促进急性肝损伤的肝再生[16]。因此，通过基因和细胞结合治疗疾病已经成为现在研究的热点。在本研究中，我们给hUC-MSCs加载IL-8RA/B，探讨其在体外向IL-8和损伤内皮迁移的能力。

IL-8RA/B是趋化因子IL-8的特异性受体，IL-8作为趋化因子家族的一员在很多炎症疾病中扮演着重要角色[17]，特别是在损伤部位，IL-8分泌增多，并且能够招募中性粒细胞，促进中性粒细胞向损伤和炎症反应部位粘附、募集，这主要是由于它和中性粒细胞表面的IL-8RA/B相互作用[17]。刘等人研究了SDF-1、IL-8、bFGF3种细胞因子在体外对骨髓间充质干细胞的趋化作用，结果显示在100 ng/mL时，SDF-1和IL-8的趋化作用优于bFGF，并且二者的作用峰值和趋化的细胞数目都比较接近[18]。参照IL-8的浓度，在本研究的Transwell实验中，我们在下室加入100 ng/mL的IL-8因子，结果表明IL-8能够明显促进hUC-MSCs向下室迁移，并且过表达IL-8RA/B的hUC-MSCs迁移的细胞数目明显多于未转染组。Takashi等人在研究IL-8体外促进终末内皮细胞(OEC)的成血管能力时，对OEC向IL-8趋化性也做了研究，OEC表达IL-8RA/B，它能够向IL-8趋化[19]，这和我们的实验结果是一致的。

另外，本研究中我们观察到过表达IL-8RA/B的hUC-MSCs粘附在TNF-α处理过的内皮细的数目更多，也有力地说明了IL-8/IL-8RA/B促进了MSCs的归巢。在血管损伤中，受损的内皮释放IL-8，使中性粒细胞向损伤部位迁移，进一步加强炎症反应，最终导致内膜增生[20]。我们推测加载了IL-8RA/B的MSCs可能和中性粒细胞竞争性向损伤内皮粘附，从而减轻炎症反应。

Xing等[7]研究者建立大鼠颈动脉损伤模型，通过股静脉向大鼠输注过表达IL-8RA/B且表达GFP的大鼠动脉内皮细胞，观察到24 h在损伤部位粘附的过表达组细胞数目明显高于空质粒组，28 d血管内膜增生的情况在过表达组得到了很大改善。本研究采用hUC-MSCs，通过腺病毒转染使其过表达IL-8RA/B，通过一系列体外实验证实了IL-8受体在hUC-MSCs中表达，并且IL-8受体的过表达增强了其向IL-8因子趋化的能力，这与EC细胞作为研究对象的实验结果是一致的。鉴于MSCs具有ECs所没有的多向分化潜能，以及可以分泌多种因子促进损伤修复的作用，我们推测过表达IL-8受体的hUC-MSCs比内皮细胞修复血管内皮损伤具有更好的效果，这还有待进一步探究。