抑制CD73表达对肿瘤细胞缺血缺氧下增殖的影响

2018-08-30龚小羽

西北民族大学学报（自然科学版） 2018年2期

龚小羽，赵霏，张威，李焱，宋雷

(西北民族大学医学院，甘肃兰州 730030)

CD73，即胞外5’-核苷酶，是通过糖基磷脂酞肌醇锚定在细胞膜上的一种相对分子质量为7×104KDa的多功能跨膜糖蛋白[1-2].研究表明，CD73 在肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用.CD73可在多种恶性肿瘤组织中高表达，如结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌及人高侵袭性恶性黑色素瘤等[3-4].体外实验结果提示，CD73在多重耐药的乳腺癌细胞中表达也上调，并可增强人乳腺癌细胞的侵袭、迁移和黏附能力.此外恶性程度高的乳腺癌细胞中CD73的表达明显高于恶性程度低的乳腺癌细胞[5].由于腺苷在组织缺血缺氧预适应及损伤保护的过程中均可发挥重要作用，对其的研究也比较广泛.而CD73又在催化形成腺苷的过程中发挥关键作用，因而我们推测CD73在肿瘤细胞缺血和缺氧中具有保护作用，可能有利于肿瘤组织在上述环境下的存活.因此，通过抑制肿瘤细胞CD73的表达来进一步观察肿瘤细胞在血清剥夺和化学性乏氧预处理下细胞增殖能力的变化，以探讨其可能的机制.

1 材料与方法

1.1 试剂

RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)、青霉素、链霉素(美国Hyclone公司)；5’-亚甲基-二磷酸腺苷(APCP)(Sigma公司)；Anti-CD73-PE流式抗体(美国BD公司)；四氮甲唑蓝(MTT)(Spectrum公司)；其余试剂均为国产分析纯.

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养

乳腺癌MCF-7细胞系(购自中国科学院上海细胞库，由西北民族大学医学院中心实验室保存)，用添加10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，于37 ℃、5%二氧化碳浓度、95%湿度下常规培养.每2～3天，当细胞融合度达70%～80%时以1∶3的比例进行传代.

1.2.2 细胞增殖能力测定

生长于RPMI-1640完全细胞培养液 (含体积分数10%灭活胎牛血清、L-谷氨酰胺 2 mmol/L、青霉素和链霉素各 100 U/L) 中的处于指数生长期的肿瘤细胞，以5×103cells/mL的浓度接种于 96 孔培养板.每孔100 μL，设阴性对照组 (不加药物)、CoCl2处理组 (分别加100～800 μM浓度梯度的 CoCl2).置 37 ℃培养48 h后，每孔加入MTT液20 μL，孵育4 h后弃去培养液，加入 DMSO 150 μL，振荡摇匀，用酶标仪于 570 nm波长处测定各孔的OD值.实验重复 3 次.按下式求出抑制率：抑制率 (%) = (对照组OD均值-实验组OD均值) / 对照组OD均值×100%.

1.2.3 细胞克隆形成率

取对数生长期的MCF-7细胞分别于T25培养瓶内进行预处理.处理方式如下：①用含0.5%胎牛血清的1640培养基培养6 h模拟缺血环境；②用600 μmol/L CoCl2预处理24 h细胞模拟缺氧环境；③同时用上述两种处理方式模拟缺血及缺氧环境.以上分组预处理后消化细胞，并于60 mm培养皿内重悬细胞，控制每皿细胞数约为100～300个.待细胞贴壁后，添加APCP(60 μM)，具体分组及处理模式见表 1.培养皿于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养10～14 d后，弃去培养液.PBS漂洗后用无水乙醇固定，1 g/L结晶紫溶液染色20 min，0.1 mmol/L PBS冲洗3遍.在低倍显微镜下计数集落数(≥50个细胞数/集落).计算克隆形成率(%)= 集落数/接种细胞数×100%.相对克隆形成率(%)=(处理组克隆形成率/对照组克隆形成率)×100%.

1.2.4 流式细胞术

流式细胞术测定细胞PE标记的CD73相对荧光强度，详细步骤为：细胞经不同处理后24 h，胰酶消化重悬，PBS冲洗，4 ℃，1 500 r/min离心，滴加鼠抗人CD73-PE抗体(1∶1000)，4 ℃孵育0.5 h.PBS冲洗，离心(2 000 r/min，4 ℃)，PBS重悬细胞.用流式细胞仪测试，激发光波长488nm.小鼠IgG1来源的抗体标记作同型对照，未受处理的细胞做阴性对照.采用FlowJo 7.6.1软件分析，以未处理细胞荧光强度为基准，统计各处理后荧光信号的阳性率，每个样本计数1×104个细胞.此实验重复三次.

1.2.5 蛋白免疫印迹

采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经考马斯亮蓝法测量蛋白浓度.每个样本取相同量的蛋白上样，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭后，滴加鼠抗CD73( 稀释度1∶500) 或beta-actin ( 稀释度1∶1000) 抗体孵育过夜.鼠二抗孵育1 h 后洗脱曝光.

1.2.6 统计分析

实验数据用mean±SD表示，采用SPSS统计软件14.0进行Student’st检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

表1 MCF-7细胞克隆形成实验分组模式

2 实验结果

2.1 CoCl2对MCF-7细胞增殖的抑制结果

MCF-7分别在不同浓度CoCl2(100 μmol/L～800 μmol/L)中孵育24 h、48 h和72 h后比色分析细胞活性.图1表明CoCl2对MCF-7细胞具有浓度依赖性的抑制效果，并且随着共孵育时间的延长，这种抑制效应更为明显.处理24 h、48 h和72 h后出的IC50值分别为648±21 μmol/L、620±12 μmol/L和483±19 μmol/L.在后续实验观察不同处理对细胞克隆形成的实验中，我们采用600 μmol/L CoCl2预处理细胞24 h，确保既能观察到细胞增殖受到抑制的明显现象，又不会导致细胞大量死亡.

图1 MTT比色法分析CoCl2对MCF-7细胞的抑制率

2.2 不同处理对MCF-7细胞CD73表达量的影响

DS：含0.5%胎牛血清的培养基预处理；CoCl2：含600 μM CoCl2培养基预处理； DS+CoCl2：上述两种处理同时进行.

图2不同预处理24 h后细胞CD73表达情况

由图2可见，与对照组比较，血清剥夺、CoCl2处理和两种方式同时处理均可使MCF-7细胞CD73表达量明显增加.

2.3 APCP抑制MCF-7细胞CD73表达的效果

以小鼠抗IgG流式抗体做为同型对照，MCF-7细胞与APCP(60 μmol/L)共孵育24小时后用PE连接的anti-CD73抗体染色，用BD Calibur 流式细胞仪检测CD73表达量.图3 表明未处理的MCF-7肿瘤细胞表达CD73抗原(34.7±3.3).当使用APCP抑制剂(60 μmol/L)后可明显抑制CD73的表达(2.99±0.31).说明MCF-7细胞表达CD73，用APCP可有效抑制CD73表达，便于后续实验的观察.

2.4 不同缺血缺氧处理对MCF-7细胞存活的影响

表2所示，与对照比较无血清、CoCl2及NSM+CoCl2处理均导致细胞克隆存活率显著降低.其中尤以CoCl2为甚，分别下降75.1%(加CD73抑制剂)和87.9%(不加抑制剂).NSM+CoCl2处理细胞存活率降低，但与单纯血清剥夺和缺氧相比存活水平较高.表明两种处理叠加引起细胞适应性增殖.CD73的抑制可影响细胞存活，在血清剥夺和CoCl2单纯处理时更为显著.

Isotype：小鼠抗Ig-G同型对照；Control：未处理的MCF-7细胞；APCP：60 μM APCP处理MCF-7细胞24 h.

图3流式细胞仪分析APCP抑制MCF-7细胞表面CD73表达

表2不同处理对MCF-7细胞存活的影响

上述处理中抑制CD73表达导致细胞存活率提高，表明在该情况下CD73表达对细胞生长不利.

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是引起女性死亡的重要原因[6].本实验通过抑制乳腺癌MCF-7细胞中CD73的表达，采用肿瘤细胞的血清剥夺法培养及化学性缺氧观察肿瘤细胞缺血缺氧预适应现象及其变化.缺血预适应(Irc)是机体组织或器官在经受一次或者多次短暂性缺血后，导致机体内源性保护机制激发来保护机体，降低后续严重缺血对机体产生的破坏等影响[7].体外实验证实CD73的过表达能够促进肿瘤生长.应用短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)干扰CD73的表达，可以诱导肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞增殖[8].本实验用APCP处理肿瘤细胞后，CD73表达水平降低，同时可见肿瘤细胞的增殖受到了明显的抑制.这与文献报道肿瘤细胞增殖抑制效果有APCP剂量依赖性相符[8-9].表明MCF-7增殖能力与CD73表达关系密切.此外，Bavaresco[10]等发现，用APCP处理神经胶质瘤细胞后肿瘤细胞的增殖活性降低30%，然而用腺苷处理过的肿瘤细胞的增殖活性升高了35%.此外，2个独立的研究[11-12]得到相同的结论： CD73与乳腺癌的淋巴结转移密切相关.

上述研究表明，CD73可以显著地促进肿瘤细胞生长和转移[13]. MCF-7肿瘤细胞在环境胁迫下可增强表达CD73水平，表明细胞发生适应性改变，可能与增加腺苷水平有关.血清剥夺、CoCl2处理或叠加处理等胁迫方式均对细胞生长有抑制作用，尤其是CoCl2造成的单纯缺氧对MCF-7抑制情况更为明显.叠加处理反而对细胞抑制作用较轻，表明肿瘤细胞缺血和缺氧具有一定程度的相互拮抗作用.同时，这种拮抗作用发生时更有利于肿瘤细胞的存活(从数据看出，APCP与其他处理之间没有交互作用，P=0.18).无血清组和CoCl2单纯处理细胞CD73抑制比非抑制存活更高(P<0.05).表明肿瘤细胞在单纯缺血或缺氧环境下其CD73的高表达反而对生长更为不利.这个结果与许多研究中发现肿瘤细胞CD73的高表达与肿瘤恶性预后看似矛盾.我们推测CD73的表达水平与细胞活性之间存在反馈调控机制.过高的CD73表达水平反而在胁迫环境下加速细胞的死亡.当然这个问题还需要进一步的实验验证.