复方中药洗剂组方的体外抑菌实验研究

郭姝彤， 艾彩莲， 李宝莉

(延安大学医学院， 陕西 延安 716000)

据WHO统计，全球每年生殖道感染的新发病例数高达3.33亿[1]。在我国，近半数城乡育龄妇女患有一种或多种下生殖道感染，其中细菌性阴道炎、真菌性阴道炎和滴虫性阴道炎的检出率最高，而细菌性阴道炎是育龄妇女最常见的阴道感染性疾病。全世界有数百万妇女患念珠菌性阴道炎(真菌性阴道炎)，随着抗生素和皮质类固醇药的普遍应用，阴道念珠菌逐渐增多，直接影响到妇女的身心健康与生活质量。目前治疗的阴道炎药物已有许多，但市场上尚无兼有治疗和保健双重作用的药物， 国内外也未见由五倍子、 白芷为主药的 8 味中药组成的复方液体制剂，因此研究抗菌、消炎、镇痛、增强免疫力、调节内分泌、安全性高、方便患者使用和携带的药物显得尤为重要。

延安大学医学院李宝莉教授自发研制的复方中药洗剂对各种阴道炎不仅有针对性的治疗作用，通过调整阴阳、补虚泻实、扶正祛邪的整体辨证观，治疗阴道炎症并调节机体内环境，改善全身状态，提高机体抵抗力，增强阴道的自净作用。其中的8味单药都具有一定的抑菌作用[2-10]，其研究开发运用于临床后将会产生深远的意义。为此，本研究将复方中药洗剂选用正交t值法实验设计表合理安排出坤泰合洗剂中不同单药及其剂量配比形成的所有组方，通过体外抑菌实验筛选出最优组方及其剂量配比，为临床治疗阴道炎用药做前期研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 中药材 白芷、五倍子、人参、石斛、当归、丁香、珍珠、川芎，以上8味中药都采购于延安大学附属医院中药库。

1.1.2 菌种与培养基 白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231、大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)ATCC27337、阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)ATCC14018共5种标准菌株，均购于北京中原公司ATCC标准菌株。肉汤培养基、营养琼脂培养基购于北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，MARKⅡ全自动厌氧微需氧培养系统(荷兰MART微生物公司)，ZHWY-100B型恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)、高压蒸气灭菌锅(天津博讯实业有限公司)等。

1.2复方中药洗剂最优组方的确定

1.2.1 组方实验设计 采用“正交t值法实验设计表”确定复方中药洗剂中不同单药剂量配比所形成的所有组方，通过体外抑菌实验，观察出不同剂量配比的五倍子、白芷、人参等组成的复方中药药液对阴道常见5种ATCC标准菌株体外最低抑菌浓度(MIC)的影响，从而筛选出抑菌效果最好的1个组方，最后确定该洗剂的最优组方及其剂量配比。8味单药即白芷、五倍子、丁香、川芎、人参、当归、珍珠、石斛，依次分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示，设定1、2两个水平，1水平为高剂量，2水平为低剂量，见表1。采用“正交t值法实验设计表”八因素两水平安排并设计12种不同的组方，见表2。

表1 因素水平表/g

表2 正交t值法实验设计表

1.2.2 组方体外抑菌实验方法

1.2.2.1 组方的提取及其制备 在最佳提取工艺条件下[11]，将组方中每味中药打粉后过筛(按照表2“正交t值法实验设计表”的12种组方等比例缩小40倍)，共称取5.5 g粉末，分别加入200 mL 80%乙醇于圆底烧瓶中，置于索氏提取器中进行药液初步提取；将初步提取所得药液抽滤后置于旋转蒸发仪内回收乙醇，干燥后获得药物粉末；最后使用10 mL容量瓶进行药液标定，封口以备用。

1.2.2.2 抑菌实验 取一接种环菌液均匀涂布于营养琼脂培养基上，每个平板内打4个圆孔，向每个圆孔里加入40 μL相同浓度的不同药液。将需氧菌于电热恒温培养箱内37℃培养24 h，厌氧菌先放入厌氧罐后置于同一培养箱内37℃培养48 h，待培养好后，测量平板上抑菌圈的直径。实验重复10次，结果取其平均值。

2 结果

2.112种组方的体外抑菌作用组方(1)～(10)的体外抑菌作用优于组方(12)，组方(11)对白色念珠菌、大肠杆菌、厌氧消化链球菌和阴道加德纳菌的体外抑菌作用优于组方(12)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 12种组方的体外抑菌作用

注:与组方(12)比较，▲P<0.05。

2.2最优组方的确定组方(1)～(10)的体外抑菌作用优于组方(12),经比较差异有统计学意义(P<0.05)。组方(1)～(7)、(9)的体外抑菌作用优于组方(12),差异有统计学意义(P<0.05)。组方(1)、(4)的体外抑菌作用优于组方(12)，差异有统计学意义(P<0.05)。组方(1)～(10)的体外抑菌作用优于组方(12)，差异有统计学意义(P<0.05)。组方(1)～(9)的体外抑菌作用优于组方(12)，差异有统计学意义(P<0.05)。组方(1)对白色念珠菌、大肠杆菌、厌氧消化链球菌和阴道加德纳菌的抑菌作用，见表4～8。

2.3复方药效学的参数值8味单药对5种ATCC标准菌的抑菌作用都以高剂量的贡献值大，除白色念珠菌的珍珠高剂量和低剂量相当，厌氧消化链球菌的人参高剂量和低剂量相当，而阴道加德纳菌的石斛以低剂量为大。根据8味单药的贡献值大小，排列顺序依次为：白色念珠菌：A1>B1>D1>F1>H1>E1>C1>G1；大肠杆菌：A1>B1>D1=H1>C1=E1>F1>G1；金黄色葡萄球菌：A1>D1>G1>F1>C1>B1>H1>E1；厌氧消化链球菌：A1>B1>F1>C1>D1>G1>H1>E1；阴道加德纳菌：A1>B1>D1=F1>E1>C1=H2>G1；经综合考虑，单药的贡献值由大到小为A、B、D、F、C、H、E、G，即白芷、五倍子、川芎、当归、丁香、石斛、人参、珍珠粉，见表9。

2.4配伍组的相互作用12种组方中各单药对5种ATCC标准菌的抑菌作用,有相加或拮抗作用。白色念珠菌：组方(3)～(7)、(9)和(10)相互叠加起相加作用，而组方(1)、(2)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；大肠杆菌：组方(1)、(2)、(11)、(12)相互叠加起相加作用，而组方(3)～(10)相互起拮抗作用；金黄色葡萄球菌：组方(2)、(4)、(5)、(7)、(9)和(10)相互叠加起相加作用，而组方(1)、(3)、(6)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；厌氧消化链球菌和阴道加德纳菌：组方(1)、(2)、(5)、(8)、(10)和(12)相互叠加起相加作用，而组方(3)、(4)、(6)、(7)、(9)和(11)相互起拮抗作用，见表10。

表4 12种组方对白色念珠菌的正交t值实验结果与组间比较

注：水平1为高剂量，水平2为低剂量。

表5 12种组方对大肠杆菌的正交t值实验结果与组间比较

注：水平1为高剂量，水平2为低剂量。

表6 12种组方对金黄色葡萄球菌的正交t值实验结果与组间比较

注：水平1为高剂量，水平2为低剂量。

表7 12种组方对厌氧消化链球菌的正交t值实验结果与组间比较

注：水平1为高剂量，水平2为低剂量。

表8 12种组方对阴道加德纳菌的正交t值实验结果与组间比较

注：水平1为高剂量，水平2为低剂量。

表9 不同单药抑菌活性对组方药效学的贡献值

注: 参数值:“+”代表促进作用，“-”表示抑制作用；水平1为高剂量，水平2为低剂量。

表10 12种组方对5种ATCC标准菌的正交t值配伍组相互作用性质

注：Q：相互作用指数，Q>0：协同作用，Q<0：拮抗作用，Q=0：相加作用。

3 讨论

不同中药提取物的抑菌活性不同，大多数中药的有效提取物对细菌、病毒等都有一定的作用[12]。本研究结果表明，12种组方对白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、厌氧消化链球菌和阴道加德纳菌5种ATCC标准菌株均有一定的抑菌效果，以组方(1)的t值最大，P值最小。本实验研究发现，8味单药对5种ATCC标准菌株的抑菌作用都以高剂量的贡献值大，除白色念珠菌的珍珠高剂量和低剂量相当，厌氧消化链球菌的人参高剂量和低剂量相当，而阴道加德纳菌的石斛以低剂量为大。8味单药对不同标准菌，贡献值的大小不同，经综合考虑，单药的贡献值大小，排列顺序依次为白芷、五倍子、川芎、当归、丁香、石斛、人参、珍珠。12种组方中各单药对5种ATCC标准菌株的抑菌作用,有相加或拮抗作用。白色念珠菌：组方(3)～(7)、(9)和(10)相互叠加起相加作用，而组方(1)、(2)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；大肠杆菌：组方(1)、(2)、(11)、(12)相互叠加起相加作用，而组方(3)～(10)相互起拮抗作用；金黄色葡萄球菌：组方(2)、(4)、(5)、(7)、(9)和(10)相互叠加起相加作用，而组方(1)、(3)、(6)、(8)、(11)和(12)相互起拮抗作用；厌氧消化链球菌和阴道加德纳菌：组方(1)、(2)、(5)、(8)、(10)和(12)相互叠加起相加作用，而组方(3)、(4)、(6)、(7)、(9)和(11)相互起拮抗作用。

复方中药洗剂组方的体外抑菌实验研究中，12种组方对5种ATCC标准菌株的抑菌作用实验结果受外界许多因素的影响，如培养基的类型及其pH值、标准菌的种类、接种菌量的多少、培养的温度等，体外实验结果和临床应用效果也存在差异。故本实验结果只是在一定条件下12种组方对5种ATCC标准菌株的体外抑菌作用结果。

本研究显示12种组方对5种ATCC标准菌均有一定的抑菌作用，以组方(1)的抑菌效果最强，即高剂量组方为最优。组方(1)也是复方中药洗剂的原方，以白芷和五倍子为君药(即主药)，当归、丁香、石斛、人参和珍珠粉为臣药，川芎为佐使之药。

本研究是在复方中药洗剂单药体外抑菌实验的基础上开展的工作,采用体外抑菌实验对12种组方初步进行了研究，但不能说明有拮抗作用的组方抑菌效果不好，有待进一步研究。另外，本实验只是初步进行了最优组方筛选的体外抑菌实验,还需对复方中药洗剂的体内研究，为今后投入临床应用提供可靠依据。