体外受精D5和D6冻融囊胚移植妊娠结局的比较

赵 静， 胡 泊， 王 鹏， 王致辉， 朱玥洁， 巩晓芸

(新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心， 乌鲁木齐 830054)

随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)实验室培养体系和培养环境的不断改进和不断完善，让胚胎在体外环境进一步发育到囊胚阶段进行移植已经成为众多生殖中心的常规应用策略[1]。延长胚胎在体外培养的目的是形成比卵裂期胚胎有更好发育潜能的胚胎，剔除卵裂期形态正常而染色体异常的胚胎，最终达到提高临床妊娠率和活产率的目的[2]。但是在临床工作中关于囊胚的选择方面还存在诸多问题。 由于胚胎发育速度不完全同步，第5日(D5)和第6日(D6)都能形成囊胚，究竟什么时期什么阶段的囊胚更具有发育潜能，一直以来是囊胚选择的争论点[3]。因此，本研究通过回顾性分析本中心407例行冷冻囊胚复苏移植患者的临床资料，比较移植D5和D6囊胚的主要临床指标，旨在选择最合适的囊胚冷冻时机，为临床工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象回顾性分析2015年1月-2016年12月年在新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心进行冻融囊胚移植的407个周期613个囊胚，年龄28～42岁，不孕年限2～8年，其中男方因素不孕83例(男性少弱精症或无精症，20.4%)，女方因素不孕274例(输卵管盆腔因素、排卵障碍、子宫内膜异位症等，67.2%)，不明原因不孕50例(12.4%)。根据冷冻囊胚的时间，将研究对象分为D5组(221个周期384个囊胚)和D6组(186个周期229个囊胚)，所有研究的囊胚均经患者同意并签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1 囊胚的分期和质量标准 参照Gardner等提出的的囊胚分期和分级标准[4]： 1期囊胚为早期囊胚，囊胚腔体积小于囊胚总体积的1/2；2 期囊胚为囊胚腔体积大于或等于囊胚总体积的1/2； 3期囊胚为完全扩张囊胚,囊胚腔占据整个囊胚；4期囊胚为完全扩张囊胚,囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大,透明带变薄； 5期囊胚为正在从透明带孵出的囊胚； 6 期囊胚为完全从透明带孵出的囊胚。内细胞团(innercell mass，ICM)： A级：形态规则，直径在60 μm以上，细胞大小均匀，融合；B级：形态不规则，直径在60 μm以上，细胞大小不匀，有相当一部分没有融合；C级：明显小于正常大小，细胞数极少。滋养外层(trophectoderm， TE)： A级：沿囊胚“赤道面”分布的细胞数明显超过10个，大小均匀，在囊胚底面的细胞全部形态清晰，大多数可见细胞核；B级：沿囊胚“赤道面”分布的细胞数10个左右，大小欠均匀，在囊胚底面的部分细胞形态清晰，部分可见细胞核；C级：沿囊胚“赤道面”分布的细胞数明显少于10个，大小明显不均匀，滋养细胞与透明带之间有明显的碎片残留，囊胚底面的细胞难以辨认。本中心的囊胚移植和冷冻标准： D5 和D6天3期及3期以上分期囊胚； 囊胚质量 ICM和TE分级均为B及以上； ICM和TE有一项分级为C者废弃。

1.2.2 囊胚冷冻前处理选择 D5和 D6 囊胚移入30 mL CSC(美国，Irvine Scientific 公司)+10%SSS(美国，Irvine Scientific 公司)的培养液滴内 ，采用激光皱缩方法进行人工皱缩，在激光镜头下，避开囊胚ICM，在透明带与滋养外胚层交界处给予单个2.0 ms的脉冲打孔，然后待细胞团皱缩后冷冻 。

1.2.3 囊胚冷冻 本中心选择商品化囊胚冷冻液Vitrification Freeze Kit 90133DSO (美国，Irvine Scientific 公司)进行玻璃化冷冻。冷冻方法参照剂说明书。将皱缩的囊胚放入50 μL的ES平衡液8～10 min，用吸管反复吹吸囊胚几次，使其更好平衡，然后移入50 μL VS冷冻液，90 s之内将囊胚装载于Cryotop载体上 ，迅速投入液氮内保存。

1.2.4 囊胚复苏及复苏后处理 本中心选择商品化囊胚复苏液Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit 90137-SO(美国，Irvine Scientific 公司)进行复苏。复苏方法参照剂说明书。解冻时将 Cryotop 取出后直接浸入预热好的37 ℃解冻液(TS)中1 min， 然后将胚胎依次挪入室温平衡好的稀释液(DS)4 min和洗涤液(WS)中8 min。复苏好的囊胚行激光辅助孵化。选择在远离TE且ICM细胞间隙的透明带位置打孔，衡量孔径大小的标准以内细胞团宜孵出为准。操作完毕后将囊胚移入培养液，置于三气培养箱内培养2 h，待移植前在高倍显微镜下统计存活率。

1.2.5 内膜的准备 自然周期：适用于月经周期正常、有自发排卵者。月经周期第8天至第10天起行阴道B超监测卵泡发育。当优势卵泡直径>1.4 cm时，每日B超监测一次，并根据情况检测尿黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)、雌二醇(Estrogen, E2)、孕酮(progestin，P)。若B超监测已排卵，第5日(D5)为解冻日。人工周期：适用于月经不规律或自然周期监测无自发排卵的患者， 从月经第3日起口服戊酸雌二醇，用药剂量和天数根据内膜情况调整。阴道B超监测子宫内膜厚度达到7～8 mm 以上时，E2达到150～200 pg/mL以上，给予黄体酮20 mg肌注，第5日(D5)为解冻日。

2 结果

2.12组患者基础临床资料比较2组患者在年龄、不孕年限、BMI、既往周期数、周期方案和不孕类型方面比较，均未见明显差异(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 2组患者基础临床资料比较

2.22组周期特征比较2组患者的基础内分泌水平和转化日子宫内膜厚度、移植日子宫内膜厚度、移植囊胚个数以及囊胚复苏率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 2组周期特征比较

2.32组妊娠结局的比较D6组的临床妊娠率显著高于D5组(P<0.05)，胚胎种植率也显著高于D5组(P<0.05)，差异有统计学意义。2组早期流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 2组患者妊娠结局的比较/例(%)

3 讨论

选择具有发育潜能的胚胎进行移植，是体外受精-胚胎移植技术成功的一个关键因素。但是目前在胚胎筛选方面还存在很大的局限性。随着培养体系和培养环境的改善，延长胚胎培养时长至囊胚阶段，能够筛选出发育潜能好的胚胎，同时囊胚时期胚胎移植与生理情况更加吻合，因此囊胚培养、囊胚冷冻和囊胚移植技术的临床常规应用前景广阔。冻融囊胚移植的优势在于：第一，囊胚移植能够淘汰在胚子基因组激活之后由于基因或代谢缺陷影响胚胎发育的胚胎，有报道显示进行冷冻的卵裂期优质胚胎有59%具有染色体或基因组学的异常，而冷冻的优质囊胚仅有35%有染色体或基因组学异常[5]；第二，冷冻囊胚的复苏率高。因为囊胚的滋养细胞层细胞数量多而且修复能力强，少数细胞死亡后对胚胎发育能力影响小，冻融囊胚可以减少患者冻融胚胎的损失率。囊胚形成时间有第5天、第6天，甚至第7天，选择何时何种质量的囊胚，一直以来没有定论。有学者认为，D5和D6囊胚的临床妊娠率和种植率没有明显的统计学差异[6-7]。国内王雪等[8]的研究结果发现D5囊胚的种植率和活产率高于D6，但差异无统计学差异。而另一些学者的研究发现D5囊胚移植的临床妊娠率和植入率均高于D6囊胚移植[9-11]。

在本研究中，结果显示解冻复苏周期中囊胚的发育天数对妊娠结局有影响，D6囊胚移植者的种植率和临床妊娠率均高于D5 囊胚移植者，而两组患者基础临床资料、基础内分泌、流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率等情况均无统计学差异，与文献[12-14]研究结果不一致。分析原因可能有以下三点 ：一是无论D5还是D6囊胚，本中心一律准备第五天的内膜进行移植，第五天的内膜具有更好的容受性，这点与文献报道不同；二是本中心对可利用囊胚质量的要求严格，无论TCM还是TE，有C级出现均不予利用，保证D5与D6总体囊胚的质量上没有差异；三是本研究通过分析数据发现，D6囊胚均为4期及以上的囊胚，而D5囊胚有18%(69/384)为3期囊胚。有研究表明，预测临床妊娠率和活产率一个重要的因子是囊胚的扩张状态[15]。4期及4期以上的囊胚扩张状态更好，可能更具备发育潜能，而且和D5的子宫内膜有更好的容受性。

综上所述，本中心冻融囊胚移植周期D6的囊胚临床妊娠率优于D5囊胚，其发生机制仍需要进一步的探索。在临床工作的现阶段，如何合理地细化囊胚冷冻选择的标准，并且更大程度提高胚胎的可利用率，是辅助生殖技术领域今后重点研究方向。