宫颈鳞癌患者外周血中HPV16 L1和L2特异性CTL免疫反应相关性分析

范佩文， 秦永辉， 玛依努尔·阿里甫，王若峥,

(1中国医学科学院肿瘤免疫与放疗研究重点实验室， 乌鲁木齐 830011； 2新疆医科大学附属肿瘤医院放疗中心， 乌鲁木齐 830011)

宫颈癌(cervical carcinoma, CC)是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，根据中国癌症中心统计的数据，2015年我国新发的宫颈癌患者近10万例，其中约3万例患者死于该病[1]。可见宫颈癌仍是我国重大的公共健康问题。宫颈的鳞柱交接部是病毒性肿瘤转化的最大危险区域，发生于该交界区的多为宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)，占宫颈癌的80%[2]。

随着宫颈癌细胞生物学和分子生物学研究的不断深入，许多研究已证实人乳头状瘤病毒(humanpapilloma virus, HPV)感染与宫颈癌的发生、发展密切相关。大量研究认为HPV16和18等高危型HPV的持续感染是发展为宫颈癌的中心环节，其感染大约占所有宫颈癌HPV病毒感染的70%，其中能够引起CSCC的HPV16占50%以上[3-5]。HPV是小而无包膜的双链环状DNA，其全基因组为8 kb，能够编码6个具有调节功能的早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)和2个参与蛋白衣壳形成的晚期蛋白(L1和L2)[6]。其中，L1蛋白是HPV的主要衣壳蛋白，具有较强的免疫源性，能刺激机体产生中和抗体免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)和免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)[7]；L2蛋白为次要衣壳蛋白，与HPV抗原多态性有关。L1和L2蛋白主要在病毒颗粒侵入宿主机体后起协调和识别作用。

目前，关于HPV16 L1和L2抗原蛋白的研究多见于细胞涂片及组织切片中，而关于血液中的免疫应答反应研究较少，本研究采用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)，使用 HPV16 L1和L2抗原多肽刺激CSCC患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，检测特异性T细胞免疫反应的水平，了解其与患者的临床特征之间的相关性，为CSCC患者免疫治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1研究对象选择2014年3月-2016年7月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院，经病理明确诊断且临床资料完整的CSCC患者118例为研究对象。患者年龄34～78岁，中位年龄56岁；根据2009年国际妇科联盟(FIGO)子宫颈癌临床分期标准：Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳa期患者42例；经本院检验科行HPV定性检测，HPV16阳性患者86例，阴性32例。

1.2主要仪器与试剂酶联免疫斑点分析仪(AIDv Spot Reader Spectrum)购自德国AID公司；ELISPOT试剂盒及HPV16 L1和L2抗原肽均由英国牛津大学MRC人类免疫学实验室提供；含硝酸纤维素膜(PVDF)的96 孔板购自美国 Millipore 公司；胎牛血清、RPMI 1640细胞培养基、人淋巴细胞分离液、植物血凝素(PHA)和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国 Sigma 公司；ABC显色液购自美国Hyclone公司；青链霉素和台盼蓝购自上海生工生物技术有限公司。

1.3L1和L2蛋白特异性CTL免疫反应检测

1.3.1 外周血单个核细胞(PBMC)采集 抽取患者肘静脉血10 mL(EDTA抗凝)，采用密度梯度离心法分离PBMC，台盼蓝染色计数，将细胞重悬，调整终浓度为3×106个/mL用于进行ELISPOT检测。

1.3.2 酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测 从GenBank中筛选出目前世界公认的Consensus Subtype序列覆盖HPV16 L1 58条和L2 57条全基因序列的重叠肽，由牛津大学MRC人类免疫学实验室合成。按照ELISPOT试剂盒的说明书进行HPV16 L1和L2抗原重叠肽免疫反应检测；按说明书配制ALP显色液，每孔加入100 μL，加盖后室温下放置15 min显色。

1.3.3 ELISPOT实验结果的判定标准 采用酶联斑点分析系统处理数据，96孔板上显示的每一个斑点都对应一个分泌细胞因子的CTL，即斑点形成细胞(spots forming cell, SFC)，结果采用SFC/106PBMCs表示。阳性判断标准为实验孔斑点数≥3倍的阴性对照孔斑点数，且实验孔斑点数≥25 SFC/106PBMCs，阴性对照孔<30 SFC/106PBMCs[8]。

1.4统计学处理应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计学分析，符合正态分布的2组间计量资料的比较采用独立样本t检验；非正态分布的数据的比较采用秩和检验；计数资料用百分比表示，组间差异由卡方或四格表Fisher确切概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CSCC患者HPV16L1和L2抗原特异性CTL免疫反应宫颈鳞癌患者外周血中HPV16 L1和L2特异性CTL免疫应答阳性率分别为31.4%(37/118)和16.9%(20/118)；平均反应强度分别为36.3及30.3 SFC/106PBMC(图1)。

图1 118例CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2

2.2CSCC患者HPV16L1和L2抗原特异性CTL免疫反应频率与临床特征比较HPV16 L1和L2特异性抗原多肽反应频率在临床分期Ⅰ～Ⅱ期组均高于Ⅲ～Ⅳ期组(40.8%和14.3%，P=0.003；25.0%和2.4%，P=0.002)；在HPV16阳性组均高于阴性组(39.5%和9.4%，P=0.002；22.1%和3.1%，P=0.015)，余临床特征比较差异均无统计学意义(表1)。

2.3CSCC患者HPV16L1和L2抗原特异性CTL免疫反应强度与临床特征比较HPV16 L1特异性抗原多肽反应强度在组织学类型中，菜花型>空洞型>结节型>其他类型(P=0.019),HPV16 L2特异性抗原多肽反应强度在≤56岁组高于>56岁组(P=0.012)，余临床特征比较差异均无统计学意义(表2)。

3 讨论

宫颈癌仍然是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤。大量研究证明，HPV感染是引起宫颈癌发生、发展的必要条件，其中HPV16、18、31、45、52和58等高危型HPV病毒感染占所有亚型感染的80%，是导致宫颈癌前病变和宫颈癌的最主要因素之一[9]，报道显示90%以上的CSCC均可以检测到高危型HPV的感染[10]。

表1 118例CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2特异性CTL反应频率与临床特征比较/例(%)

表2 118例CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2特异性CTL反应强度与临床特征比较/(SFC/106 PBMCs)

HPV病毒结构简单，由蛋白衣壳包裹双链闭环DNA组成的球形颗粒，直径约为50～55 nm。其蛋白衣壳由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成，约占病毒总质量的80%～90%左右[11]。L1衣壳蛋白是主要的特异性抗原，高度保守，其分子质量约为58 kD，能自组装成在形态学和免疫学上与天然HPV病毒高度相似的类病毒颗粒( virus like particle，VLP)[12]，在病毒感染细胞初期具有重要作用，参与细胞表面受体的相互作用[13]。L2衣壳蛋白高度可变，其分子质量约为51 kD，协助L1组装成病毒颗粒，在病毒感染过程中发挥重要作用，其参与病毒感染的整个过程[14]。目前关于HPV16 L1 VLPs的预防性HPV疫苗已经上市，L2型疫苗也在研发当中。基于这两个蛋白的治疗性疫苗研究也已开展。Pinto等[15]的一项临床II期试验结果显示，HPV16 L1 VLPs疫苗不仅能引起强烈的B细胞反应，还可诱导T细胞增殖，并观察到了干扰素伽玛(interferon-γ， IFN-γ)等细胞因子明显增加。蒋蓉等[16]构建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)与HPV L2抗原的融合蛋白，在大肠杆菌中重组表达形成病毒样颗粒结构；通过小鼠模型检测后得出HBc-L2 VLPs可以有效地增强L2抗原的免疫原性，并可刺激机体产生针对多型HPV的免疫保护力。Hitzeroth等[17]研究发现，使用HPV16 L2 DNA疫苗和HPV16 L2蛋白均诱导产生中和抗体，而被L2 DNA疫苗免疫的小鼠肿瘤体积缩小了50%，这说明L2 DNA的体内表达可以产生细胞免疫，控制肿瘤生长。以上研究结果表明，L1和L2蛋白均能诱导产生细胞免疫反应，可能成为治疗性疫苗的新的靶抗原。

在正常生理情况下，大多数HPV感染是暂时性的，约90%的HPV病毒在感染后两年内被宿主的天然免疫系统而自发性清除，只有宫颈上皮细胞长时间受HPV病毒感染刺激而化生不良，导致局部组织癌变[18-19]。研究表明，高危型HPV病毒的持续性感染导致的宫颈免疫细胞和炎性细胞等肿瘤微环境的紊乱是宫颈癌发生不可忽视的致癌机制[20]。HPV感染后诱导T细胞(恶性肿瘤特异性免疫的主要效应细胞)的活化，并参与清除病毒感染或CC发生的病理过程。ELISPOT技术检测T细胞对HPV等病毒抗原肽的特异性细胞免疫应答研究中比较成熟，广泛应用于抗原蛋白重叠肽细胞表位的筛选及鉴定、治疗性疫苗的设计、动物模型和临床试验等[21]。本实验室前期研究结果显示，L1肽段反应频率和强度略高于其他肽段，但由于病例数较少，各肽段未见明显差异，需进一步扩大样本量验证[22]。本研究利用ELISPOT技术检测118例CSCC患者外周血中，经合成的HPV16 L1和L2抗原重叠肽刺后，分泌IFN-γ的CTL细胞的免疫水平，阳性应答率分别为31.4%和16.9%；平均反应强度分别为36.3及30.3 SFC/106PBMC。表明HPV16 L1和L2特异性抗原多肽能够诱导CSCC患者外周血中的PBMC产生CTL免疫应答，该结果与本实验室前期在头颈部肿瘤中的HPV16 L1和L2阳性率(36.4%和 34.5%)比较显示[23]，HPV16 L2的反应频率较低，这可能与不同病种、样本量扩大以及阳性率判定标准的优化有关。通过与不同临床特征的对比研究发现，HPV16 L1和L2抗原特异性CTL反应频率在临床分期Ⅰ～Ⅱ期组均高于Ⅲ～Ⅳ期组(40.8%和14.3%，P=0.003；25.0%和2.4%，P=0.002)；提示这2个蛋白的免疫应答反应频率随临床分期的进展而降低，可能是因为晚期患者自身免疫力水平低下导致CTL免疫应答减弱；二者的CTL反应频率在HPV16阳性组均高于阴性组(39.5%和9.4%，P=0.002；22.1%和3.1%，P=0.015)，表明CSCC患者HPV16 L1和L2免疫应答反应与HPV16感染情况相关，这可能与这2个衣壳蛋白能够协同组装成具有HPV病毒效应的VPLs有关，有待于进一步验证。在反应强度方面，HPV16 L1特异性抗原多肽反应强度在组织学类型中，菜花型>空洞型>结节型>其他类型(P=0.019)，这可能是由于纳入到本研究中的宫颈鳞癌患者的宫颈外观以菜花型为主，该因素待扩大样本量进一步研究；L2特异性抗原多肽反应强度在≤56岁组高于>56岁组(13.80和7.20 SFC/106PBMCs，P=0.012)，反应相对年轻患者的整体免疫功能可能好于年龄较大者，因此所产生的CTL免疫反应强度也越强。

综上所述，CSCC患者外周血中HPV16 L1和L2抗原肽可以诱导产生特异性CTL反应，并与HPV16感染、临床分期和组织学类型等临床特征有一定相关性，有待于深入研究验证，有可能成为宫颈鳞癌免疫治疗的潜在靶点。