四种开窍药对急性不完全性脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑保护作用

黄 丽，朱彩霞，张芹欣，方永奇，李 翎*

(1.广州中医药大学,广州 510405； 2.广东省中医院珠海医院，广东 珠海 519015； 3.广州中医药大学第一附属医院,广州 510405)

中风又称脑卒中，分为缺血性中风和出血性中风，在我国以缺血性中风多发，具有高发病率，高致死率，高致残率的特点[1-2]。目前，对于缺血性中风初期，首选溶栓治疗恢复脑组织供血，但供血恢复后易继发脑缺血再灌注损伤。中医药在治疗脑病中有其独特优势，特别是以石菖蒲、冰片、苏合香、麝香为代表的具有芳香走窜，开窍醒神之功的醒脑开窍药。现代研究发现这四种开窍中药，特别是其不同方法所提取的有效成分/部位作为单一药物对脑损伤均有一定的保护作用，同时此类药物在体内具有吸收快、分布快而广泛，脂溶性强、能调节血脑屏障通透性，并促进其他药物透过血脑屏障[3-6]，能维持脑兴奋-抑制平衡、减轻脑损伤[7-9]等特点。但其药效、药理作用强弱不尽相同，目前缺乏该类药物特别是有效成分、部位对脑损伤保护作用的比较研究以及对不同作用机制的探讨。同时，脑缺血再灌注损伤的机制相互影响，错综复杂，有研究表明有关氧化应激反应的相关酶(SOD、MDA、GSH-PX)，血管活性物质(ET-1、CGRP)及凋亡基因bcl-2家族参与了脑缺血再灌注损伤病理级联反应过程，是缺血性脑血管疾病病情演变及程度指标之一[10-13]，对治疗脑缺血再灌注损伤疾病的药物研究具有重要意义。

因此，本实验利用急性不完全性脑缺血再灌注大鼠模型，对比研究四种开窍药石菖蒲、冰片、麝香、苏合香的有效成分/部位(β-细辛醚、冰片、麝香酮、苏合香挥发油)在相同临床等效剂量下对模型大鼠的作用，观察此四种药对模型大鼠脑组织含水量，自由基相关酶，ET-1，CGRP，bcl-2及bax的影响，以探讨四种开窍药的有效成分/部位对脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护作用的强弱。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，180～220 g，8周龄，雌雄各半，共120只，购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2013-0034]。动物实验于广州中医药大学第一附属医院[SYXK(粤)2013-0092]，福利伦理审查表编号：TCMF1-2016008。

1.2 主要试剂与仪器

石菖蒲，康美药业股份有限公司(批号140301)；β-细辛醚由广州中医药大学第一附属医院实验中心自制，纯度为99.32%，配成1.70 g/L混悬液；冰片，康美药业股份有限公司(批号151210181)，配成10.00 g/L混悬液；麝香酮，中国食品药品检定研究院(批号110719-201215)，配成0.04 g/L混悬液；苏合香，亳州清逸中药材有限公司(批号160415)；苏合香挥发油由广州中医药大学第一附属医院实验中心自制，含量为1.0167%，配成0.20 g/L混悬液；SOD试剂盒(批号20160405)、MDA试剂盒(批号20160402)及GSH-PX试剂盒(批号20160331)均购自南京建成生物工程研究所；ET-1试剂盒(批号E116SC)、CGRP试剂盒(批号C154SC)均购自加拿大Elixir公司；胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司；破膜剂(Cell Permeabilization Kit)购自美国Invitrogen公司；bcl-2抗体(货号sc-7382)、bax抗体(货号sc-7480)购自美国Santa公司。

AL204-IC电子分析天平(Mettler Toledo仪器上海有限公司)；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)；TDL-5-A型低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；DK-8电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)；Multiskan Mk3型酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；ALTRA型流式细胞仪美国(Beckman Coulter公司),激发波长488 nm,分析软件expo32。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

适应性喂养这一周后随机分为β-细辛醚组、麝香酮组、冰片组、苏合香组、模型组、假手术组，每组20只。

1.3.2 急性不完全性脑缺血再灌注损伤模型的制备

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，仰卧固定，颈部备皮，消毒，沿颈正中线做纵向皮肤切口，显露双侧胸锁乳突肌，钝性分离，暴露双侧颈总动脉，并用动脉夹夹闭1 h后取出动脉夹再灌注，缝合、消毒。假手术组只暴露双侧颈总动脉，然后缝合、消毒。

1.3.3 给药与取材

给药组灌胃给药7 d，每天2次，10 mL/g。假手术组、模型组给予相同体积生理盐水，第7天给药30 min后，制备急性不完全脑缺血再灌注损伤模型，再灌注24 h后，大鼠麻醉，腹主动脉采血后，快速断头取全脑，测脑含水量。

1.3.4 脑含水量的测定

取脑后称湿重，85℃烤箱烘干24 h，迅速测干重，计算脑含水量。脑含水量%=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.5 SOD、MDA、GSH-Px、ET-1和CGRP的测定

取血清按试剂盒说明书操作分别用WST-1法测SOD 活力，TBA法测MDA 含量、GSH-Px活力，ELISA法测ET-1和CGRP含量。

1.3.6 bcl-2及bax的测定

将脑组织处理成单细胞悬液(约1×106)，加入封闭液(2% BSA)，涡旋后室温放置15 min，摇匀后去上清液，再把单细胞悬液按破膜剂试剂盒操作，最后加1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 四种开窍药对模型大鼠脑含水量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑含水量增高(P< 0.01)，造模成功；与模型组比较，β-细辛醚组、冰片组、苏合香组大鼠脑含水量降低(P< 0.05)，麝香酮组脑含水量有降低趋势，但差异无显著性。脑含水量比较：冰片组<苏合香组<β-细辛醚组<麝香酮组。(见表 1)

表1 四种开窍药对脑缺血再灌注大鼠脑含水量的影响Table.1 Effects of four types of resuscitation-inducing herbs on cerebral water content in model rats

注：与模型组比较，*P< 0.05,**P< 0.01；与假手术组比较，△P< 0.05，△△P< 0.01。下同。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Compared with the sham operation group，△P< 0.05，△△P< 0.01.The same below.

2.2 四种开窍药对模型大鼠血清中SOD、MDA、GSH-PX含量的影响

与假手术组比较，模型组SOD、GSH-PX含量降低(P< 0.05)，MDA含量升高(P< 0.01)。与模型组比较，冰片组、苏合香组SOD含量提高(P< 0.05)；麝香酮组、苏合香组MDA含量降低(P< 0.05)；β-细辛醚组、麝香酮组、冰片组、苏合香组GSH-PX含量均有提高(P< 0.05)，苏合香组<冰片组<β-细辛醚组<麝香酮组。(见表2)。

2.3 四种开窍药对模型大鼠血中ET-1、CGRP含量的影响

与假手术组比较，模型组ET-1含量提高(P< 0.05)，CGRP的含量降低(P< 0.05)。与模型组比较，β-细辛醚组、麝香酮组、冰片组、苏合香组ET-1含量均降低(P< 0.05)，麝香酮组<冰片组<苏合香组<β-细辛醚组； CGRP的含量无显著性差异(见表 3)。

2.4 四种开窍药对模型大鼠脑组织中bcl-2及bax的影响

与假手术组比较，模型组bcl-2，bax蛋白含量提高(P< 0.01)，bcl-2/bax比值降低(P< 0.01)。与模型组比较，各药物组bcl-2蛋白含量均提高(P< 0.05)，bax蛋白含量均减低(P< 0.05)，bcl-2/bax比值均提高(P< 0.05)，其作用强度麝香酮>冰片>苏合香挥发油>β-细辛醚。(见表 4)

3 讨论

醒脑开窍中药治疗脑病有突出优势，现代研究表明β-细辛醚、麝香酮、冰片及苏合香挥发油，多属分子量小、高度亲脂性的成分，既容易透过血脑屏障，又具有较强的神经药理作用，是一类具有“辛香走窜”、“引药上行”之性，以通关开窍、启闭醒神为主要功效的中药[14]，常用于脑损伤疾病的预防及治疗。

表2 四种开窍药对脑缺血再灌注大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX含量的影响Table.2 SOD, MDA, and GSH-PX levels for four types of resuscitation-inducing herb in model rats

表3 四种开窍药对脑缺血再灌注大鼠血中ET-1、CGRP的影响Table.3 ET-1 and CGRP levels for four types of resuscitation-inducing herb in model rats

表4 四种开窍药对脑缺血再灌大鼠脑组织bcl-2、bax的影响Table.4 Bcl-2 and Bax levels for four types of resuscitation-inducing herb in model rats

脑水肿是急性脑缺血性损伤的主要病理变化之一。脑缺血初期为细胞毒性水肿[15-16]，缺血半小时产生续发性血管源性水肿[17]。缺血时间越长，肿胀越明显，最终使血管腔狭窄，甚至堵塞，反过来又加重脑缺血[18]。其基本发病机制与细胞膜结构和功能改变，钠泵功能减退，微血管通透性增高等相关。研究表明SOD、GSH-PX是体内重要的抗氧化酶，SOD能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断自由基的毒性反应，清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤[19]，GSH-PX特异地催化GSH对过氧化物的还原反应,能清除过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[20]。本次研究中β-细辛醚、冰片、麝香酮及苏合香挥发油均能不同程度降低模型大鼠脑水肿程度，其中以冰片作用最佳，其他三种用强弱程度分别是：苏合香挥发油>β-细辛醚>麝香酮。同时，冰片、苏合香挥发油可明显升高血清中抗氧化酶SOD、GSH-PX含量，β-细辛醚组、麝香酮作用次之；麝香酮及苏合香挥发油降低脂质过氧化产物MDA作用最强，说明四种开窍药有效成分/部位均能降低脑水肿缺血再灌注损伤，其作用机制可能与减少自由基损伤，清除神经毒性相关。

ET-1、CGRP分布于中枢神经系统和血管内皮细胞中，分别具有强烈的舒缩血管作用。缺血、缺氧、再灌注损伤时，EI-1分泌增加可促进血管平滑肌收缩，加重脑组织缺血缺氧；能引起细胞内钙离子增高,可间接激活NO合成酶，导致NO增多，发挥神经毒作用[21]。CGRP是内源性ET拮抗剂，能有效地防治组织的缺血再灌注损伤[22]。本研究中各药物组均能有效降低ET-1含量，并具有增加CGRP趋势，其中以β-细辛醚组降低ET-1作用最强，说明β-细辛醚对改善脑部微循环有显著作用。

有研究证实CGRP可上调缺血再灌注脑组织bcl-2蛋白的表达，其神经保护和抗凋亡作用可能与其上调bcl-2蛋白表达有关[23]。bcl-2 与 bax 分别是 bcl-2 家族中最典型的凋亡抑制基因和凋亡诱导基因，用于多种器官缺血再灌注实验研究的凋亡因子监测指标，如心肌[24]、脑组织[13]、肝肾[25]等，研究表明bcl-2在移植器官组织中高表达[26]，并且在这些组织器官的缺血再灌注实验研究中发现bcl-2/bax组成的平衡体系的变化与细胞凋亡水平的变化相关，即bcl-2 蛋白表达增多、bax蛋白表达减少，则细胞凋亡水平下降；反之则细胞凋亡水平上升[27-28]。本次研究中β-细辛醚干预后的模型大鼠脑组织中的bcl-2蛋白表达升高，与本课题组前期刘林等[29]研究结果相同，说明β-细辛醚可能通过上调bcl-2和下调 bax的表达对脑缺血再灌注大鼠中枢神经元细胞的凋亡起到抑制作用。同时，麝香酮、冰片、苏合香挥发油干预后的模型大鼠脑组织的bcl-2蛋白，bax蛋白的表达，bcl-2/bax比值趋势与β-细辛醚一致，说明四种开窍药可能均从抑制神经元细胞凋亡角度对模型大鼠脑损伤的起到保护作用，其抑制作用强度：麝香酮>冰片>苏合香挥发油>β-细辛醚。

目前关于醒脑开窍药的研究仍有局限性，阐明其治疗神经系统疾病的作用机制，甚至发现新的促进药物入脑的成分,具有重要的意义和应用前景，本研究通过对比四种醒脑开窍类中药的有效成分/部位对急性不完全性脑缺血再灌注模型大鼠的治疗作用，加强醒神开窍共性及不同点的研究。研究发现此四种药物在脑缺血损伤中作用靶点可能不同，四药对比，冰片在降低脑含水量方面作用最佳，苏合香挥发油能有效减少氧化应激损伤，麝香酮可明显增加bcl-2蛋白，降低bax蛋白，可能通过抑制脑细胞凋亡从而起到保护脑组织的作用，β-细辛醚作用居中，整体上四种开窍药有效成分/部位对急性不完全性脑缺血再灌注模型大鼠均有保护作用，其作用机制可能与减少自由基生成，抑制脂质过氧化反应，改善微循环状态，降低脑水肿程度，减少神经细胞凋亡有关，只是脑损伤保护的作用机制和各作用点强度不同，提示可针对临床不同的脑损伤，分别选用相应的药物治疗。但本研究检测指标数量有限，方法较单一，在后续研究中将对四种醒脑开窍药治疗神经系统疾病的作用机制进行深入的研究与探讨。